“Analiza odpowiedzi roślin na stres suszy: wyciszanie ekspresji genów kinaz kaskady MAPK”

1. “Analiza odpowiedzi roślin na stres suszy: wyciszanie ekspresji genów kinaz kaskady MAPK”

2. Mitogen-Activated Protein Kinase Cascade MAPKK subfamilies(classification according to Kazuya Ichimura et al.)with phylogenetic tree Stimuli A1 MAPKKKs A2 B MAPKKs C MAPKs D Transcription factors Target genes At, Arabidopsis thaliana; Le, Lycopersicon esculentum; Ms, Medicago sativa; Nt, Nicotiana tabacum; Os, Oryza sativa; Zm, Zea mays

3. P P Hairpin RNA SHORT shRNA Pol RNA III LONG Inverted repeats Pol RNA II > 1 siRNA 1 siRNA Uzyskanie transgenicznych roślin A. thaliana z wyciszoną ekspresją genu kodującego kinazę AtMKK1. promotor terminator siRNA

4. 1 2 3 Schemat sekwencji mRNA genu AtMEK1. Za pomocą skrótów oznaczono: CDS – sekwencja kodująca kinazę AtMEK1, 5’ i 3’ region – odcinki DNA wybrane do konstrukcji odwrotnych powtórzeń, siRNA – krótkie sekwencje DNA wybrane do konstrukcji shRNA

5. Mapa wektora pHannibal. za pomocą skrótów oznaczono: amp - gen oporności na ampicylinę, promoter 35S CaMV – promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora,, pdk – intron, terminator OCS – terminator genu syntazy oktopinowej Do wprowadzenia fragmentów genu AtMEK1 wykorzystano miejsca restrykcyjne dla enzymów XhoI i KpnI oraz ClaI i XbaI Mapa plazmidu pART27 za pomocą skrótów oznaczono: LB - lewa sekwencja graniczna T-DNA, RB - prawa sekwencja graniczna T-DNA, nptII - gen fosfotransferazy neomycynowej, promoter NOS- promotor genu syntazy nopalinowej, terminator NOS - terminator genu syntazy nopalinowej, spec – gen oporności na spektinomycynę

6. Schemat konstruktu T-DNA zawierającego odwrócone powtórzenia regionu 3’ genu AtMEK1 (MKK1-3’). Za pomocą skrótów oznaczono: LB - lewa sekwencja graniczna T-DNA, RB - prawa sekwencja graniczna T-DNA, nptII - gen fosfotransferazy neomycynowej, pNOS- promotor genu syntazy nopalinowej, tNOS - terminator genu syntazy nopalinowej, p35S CMV – promotor 35S CaMV, tOCS – terminator genu syntazy oktopinowej, intron pdk – intron genu kinazy pdk

7. Konstrukcja płytek mikromacierzy cDNA • Źródła klonów cDNA: • Biological Resource Center, The Ohio State University - USA • Riken Bioresource Center –Japan • Wektory • pZL1 • pBluSKM • pBluSK2P • pCMV_SPORT6 • pFLC1 i pochodne • pSHlox1 PCR (startery T7 i T3) lub (startery T7 i Sp6) Dr Patricka Gallois - School of Biological Sciences, University of Manchester

8. Płytki384 dołkowe Oczyszczanie produktów PCR, Millipore Nadruk Płytki 96 dołkowe Stoki glicerolowe Stoki główne Kultury bakteryjne Izolacja plazmidów Stoki robocze Ocena poprzez rozdział elektroforetyczny 50 µl PCR

9. Tracking - Rozlokowanie prób na płytce • Duplikacja prób - reproduktywność wyników • Próby kontrolne • próby negatywne • ORF_o567 [Escherichia coli] - 178C16 • aconitate hydrase 1 [Escherichia coli] -239E4 • próby konstytutywne: • 18S rRNA • HMG1 (3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase) • Plastocyanin • EF1 (elongation factor 1-alpha) • Phosphoglycerate kinase • FPS1 (farnesyl pyrophosphase synthase) • beta tubulin • ubiquitin • TUFA (elongation factor Tu) • CAB (photosystem II type I chlorophyll a b binding protein) 3 • RUBISCO (ribulose bisphosphate carboxylase)

10. geny uczestniczące w biosyntezie i degradacji kluczowego fitohormonu stresu suszy - ABA- kwasu abscysynowego (m.in.. geny: epoksydazy neoksantynowej – ZEP, dioksygenazy 9-cis-epoksykroteinowej – NCED, oksydazy ksantoksyny – ABA2, lipoksygenazy – LOX2) • geny uczestniczące w transdukcji sygnałów (m.in. kinazy MAP i MAPK, fosfatazy PP2C, CDPK) • geny czynników transkrypcyjnych (m.in. MYB/MYC, bZIP, WRYK) • geny obronne (m.in. enzymy stresu oksydacyjnego, enzymy zaangażowane w procesy degradacji makromolekuł) • geny biorące udział w akumulacji i degradacji osmolitów • geny kodujące transportery błonowe (transportery jonów, metabolitów) • inne geny A. thaliana o nieznanej funkcji, które zostały wybrane na podstawie homologii sekwencji do znanych funkcjonalnie genów innych gatunków roślin; są to geny przypuszczalnie indukowane w warunkach stresu suszy.