QUIMICA FORENSE Clase n°4 Mg Diego S. Rinaldi

1. QUIMICA FORENSEClase n°4Mg Diego S. Rinaldi

2. Tema 4 Procesamiento de Muestras

3. Procesamiento de las muestras • Tóxicos que requieren pocos procesos de extracción. Ej: T. Volátiles • Tóxicos que necesitan procesos de extracción, concentración y limpieza de extracto. Ej: T.O.F • Tóxicos que requieren mineralización. Ej: Tox. Minerales

4. CONSIDERACIONES GENERALES • Análisis orientado : • Procedimientos de extracción y determinación especificas para una determinada sustancia . • Cuando los antecedentes del caso apuntan hacia la misma o si se quieren hacer determinaciones cuantitativas. • Análisis de drogas desconocidas: Esta modalidad implica la aplicación de un “screening” para descartar el mayor número de tóxicos posibles e incluir un número reducido de ellos, hasta lograr la identificación, pudiendo posteriormente aplicar una técnica directa para aumentar la posibilidad de identificarlas.

5. Tipos análisis • Orientativos en placa o tubo. Poco específicos pero muy sensibles ejemplo Reactivo de TRINDER para salicilatos o FPN para triciclicos • De screening CCD. Permiten ir descartando y afinando la búsqueda. Gran sensibilidad poco especificidad. • De confirmación, GCMS o HPLC • De cuantificación GC-MS, GC-FID, HPLC; etc.

6. Etapas • Preparación de la muestra: • Este paso es crucial en los análisis. Generalmente involucra la homogeneización de las muestras, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis (ácida, básica o enzimática), precipitación, centrifugación, etc. • Aislamiento del analito: • El método de aislamiento dependerá de la naturaleza del tóxico que se quiere aislar. • Extracciones con sales y con solventes, o sea los métodos de “saltingout”. • Extracción en fase sólida (SPE),

7. Concentración del extracto: • El objetivo de este paso es colocar el analito en el menor volumen posible y de esta manera aumentar la sensibilidad de los análisis. • Identificación del analito: • En la identificación del analito existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las técnicas que se utilicen para la detección de las mismas. • nivel primario: que utiliza técnicas de separación e identificación como la cromatografía en capa delgada (TLC) y la espectrofotometría UV • nivel secundario:(GC-MS, HPLC-MS).

8. Preparación de la muestra • Molienda y Liofilización: Para muestras sólidas como hígado o contenido gástrico. Trituración con Acido Tartárico y sulfato de Sodio Anhidro. Posterior Liofilización.

9. Hidrólisis • Hidrólisis Enzimática: • Se le añade a la muestra 60ul de una mezcla de Glucuronidasa /Arilsulfatasa y 1ml de buffer fosfato de pH=6 y se encuba 14hs a 37 °C. • Hidrólisis Alcalina: • Se le añade a la muestra 1ml de NaOH 0,1M y se coloca 24hs a 60 °C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato.

10. Hidrólisis ácida • Se la añade 1ml de H2SO4 0.05N y se encuba 12hs a 37°C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato. • Las columnas se activan con 2ml de metanol y 2ml de buffer fosfato de pH=6 lentamente y no dejando que se seque, se aplica la muestra, se lava la columna con 0,5ml de buffer fosfato y 1ml de una mezcla de buffer fosfato:metanol (80:20) y 1ml de ácido acético 1M. Se espera 2 min y se deja secar bien la columna, se centrifuga si es necesario. Se eluye con 1ml de una mezcla de Hexano:Acetato de Etilo (80:20) (con esta mezcla se eluye el THC). Posteriormente se eluye con una mezcla de diclorometano:isopropanol:amoníaco (80:20:2). (esta mezcla eluye drogas básicas).

11. EXTRACCIÓN CON SOLVENTES Tipos de Extracciones • Extracción Líquido-Líquido en ampollas • Éter de petróleo para Plaguicidas • Éter Etílico para Drogas de Carácter Ácido • Cloroformo alcalino para D.C. Básico • Extracción sólido-líquido: Columnas de Extrelut NT20, NT3 o bien SPE para HPLC, etc

12. Extracción en fase sólida(SPE) • Acondicionamiento de la columna • Aplicación de la muestra. • Lavado de la columna • Ajuste de pH (si se lo requiere) • Secado de la columna. • Elución de la droga. • Concentración del extracto.

14. Evaporación de solventes • A T° ambiente y con corriente de N2. • Redisolver el extracto y proceder a limpieza según la extracción, neutra ácida o básica por columnas con fluorosil arena lavada, etc. o por diferentes densidades o por diferentes pH. Así se obtiene un extracto limpio

15. Purificación de extractos • FRACCIÓN ETER DE PETRÓLEO ÁCIDO: • Se agrega al extracto seco 5ml de alcohol al 30% v/v, se filtra en frío y sobre la solución se hace la investigación toxicológica. • FRACCIÓN ETER ETÍLICO ÁCIDO: • Agregar 10ml de agua destilada, calentar levemente para favorecer la disolución del residuo. Enfriar. Llevar a pH=3 con ácido sulfúrico al 1% . Extraer con 20ml de ciclohexano:cloroformo (25:75). Agitar durante 5min. Filtrar la mezcla orgánica en un embudo de papel de filtro conteniendo una pequeña cantidad de sulfato de sodio anhidro, para eliminar los vestigios de humedad.Evaporar y retomar en 1ml de metanol. • FRACCIÓN ETER ETÍLICO ALCALINO y FRACCIÓN CLOROFORMO ALCALINO : • Tomar el residuo con algunos mililitros de ácido sulfúrico 5%. Extraer con éter etílico. Desechar la fracción orgánica. Alcalinizar la fracción acuosa restante con amoniaco y extraer 3 veces con porciones de 10ml de éter etílico. Filtrar ,evaporar y retomar con 1ml de metanol.

16. Metodología para el análisis de drogas en fluidos biológicos sin orientaciónSCREENING rapido • Inmunoensayos Los mas utilizados son el IEE (Inmuno Ensayo Enzimático), el RIE (Radio inmuno Ensayo), IEF (Inmuno Ensayo Fluorescente), y el IEA (Inmunoensayo por Aglutinación). • Las reacciones de coloración directamente en la orina tienen un uso limitado, solo algunas drogas pueden ser ensayadas por ejemplo: salicilatos, hidrocarburos halogenados, paracetamol, etc. • Ejemplo 2 gotas de orina+Cloruro férrico 5% (2 gotas) Violeta: posibles salicilatos

17. REACCIONES CROMÁTICAS • EXTRACTO FUERTEMENTE ÁCIDO: • Tricloruro férrico • Folin-Ciocalteu • Liebermann • Nessler • Diazotación • Koppanyi-Zwikker • NEUTRO: • Koppanyi – Zwikker • Liebermann • Nessler • BÁSICO: • P-Dimetilaminobenzaldehído • Cloruro férrico • Formaldehído – Sulfúrico • Forrest • FPN • Mandelin • Marquis

18. CCD: Cromatografía en placa delgada • En el screening por TLC y HPTLC se utilizan placas de silicagel 60 GF-254nm (con indicador de fluorescencia), y lo que varía son las fases móviles y los sistemas de revelado.

19. Placas Silicagel GF 254 • Cloroformo:Acetona (8:2) • 1) Uv 254 y 366nm. • 2) Acetato de cobalto en metanol 0.5% • 3) HgSO4 (5g deHgO + 20ml de H2SO4) • 4) Trinder o Cl3Fe Drogas de carácter ácido

20. Placas Silicagel GF 254 • Metanol:Amoniaco (100:1,5) • 1) UV 254 y 366nm • 2) Rociado con HCl 10% • 3) Observación UV 366nm (fluorescencia) • 4) NQS • 5) IodoplatInato • 6) Draggendorf Drogas de carácter básico

22. . Cuantificación del analito: • Una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se puede realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para análisis. (GC-MS, HPLC-MS).

23. BIBLIOGRAFÍA • CaferataNores “La prueba en el proceso penal” • GisberCalabuig “Tratado de medicina legal y toxicología” • Tratado de criminalística, tomos I y II, “La química analítica en la investigación del delito”.