PRINSIP DASAR & METODE KULTUR JARINGAN HEWAN Tim BiologiUnair
Kulturjaringanhewan: budidayajaringandalam media kultursehinggamamputumbuhdanmembelah • Kulturjaringanmerupakanupayamemanfaatkansifattotipotensiselsecara in vitro
Media KulturJaringanHewan • Optimalisasi media: meliputi pH, tekanan, sumberenergidansumberkarbon, asam amino, vitamin, mineral dan air. • Media dasartersusun: asam amino, asamlemak, glukosa, ion, vitamin danko-faktor ,dll. Misalnya: • Serum • Aditif : antibiotikpenisilindansteptomycin , antifungi: fungizone0,5%, danMercapto Ethanol • Sistempenyangga : sodium bikarbonat • Berdasarkanasalnya, dibagimenjadi 2, yaitu: • Media alami, yaitu media yang berasaldaricairanjaringanembriodan medium plasma darah • Media sintetik, yaitu media yang dibuatsecarakimia, misalnya: MEM, RPMI
Media alami: Plasma darah • Komponenterbesar (90%) dalamdarah • Plasma darahberfungsiuntukmengangkut sari makanankesel-selsertamembawasisapembakarandariselketempatpembuangan • Bahanalamidikelompokkandalamtigakategori, yaitu: • Koagulat, misalnyakoagulan plasma darahdankolagen. • Cairanbologis, misalnya serum. • Ekstrakjaringan, misalnyaekstrakembrio
Media sintesis dibagimenjadi 3, yaitu: • Minimum essential medium (MEM), yaitu medium dasar yang tersusunatasasam amino esensialdan vitamin. • Medium pemelihara (maintenance medium/MM), untukmemeliharaseldalammetabolismerendahdanjangkawaktuagak lama. Medium initerdiridari MEM & serum konsentrasirendah (2 – 5 %). • Medium penumbuh (growth medium) yaitu, medium yang diperkayadengannutrienuntukmenumbuhkankulturselsecaracepat, medium iniditambahkan serum cukupbanyak (10 – 20 %).
EksplanKulturJaringanHewan • Berasaldariembriodanjaringandewasa. • Jaringanembrionik yang digunakanharussteril. • Jaringanembrionikdapattumbuhdengancepat, tidaktergregasidanbermigrasidengancepat. • Mitosis padajaringanembrioniksegeraterjadisetelahdikultur. • Jaringandewasa yang tumbuhcepatadalahselepiteldanjaringan tumor.
TeknikKulturJaringanHewan • Dilakukanpadaukurantertentuuntukmeminimalkanterjadinyakontaminasi. • Harusdiperhatikan (harussteril): • Lingkungandidalamkultur (media) dandiluarkultur (udara, manusia, kondisilaboratorium) • Selamakultur, faktorfisiksepertiunsurharadanhormon. • Semuasumberkontaminasi (ruanganlaboratorium, laminerdanalat-alatbedahuntukkultur) harusditiadakan.
Berdasarkantempatuntukkulturjaringanhewanterdapat 3 teknikkulturjaringanyaitu : • Slide Culture, yaitumenumbuhkankulturselpadagelasobyekcekung. • Flask Culture, yaitumenumbuhkankulturselpadacawankultur. • Test-tube Culture, yaitumenumbuhkankulturselpadatabungreaksi, botolterutamauntukjenissel yang tidakmelekat.
Flask Culture memberikankeuntunganlebihjikadibandingkandengan slide culture. Karenajaringandapatdikultursampaibertahun-tahun. • Wadah yang baikuntuk flask culture adalah Carrel flask. • TerdapatduatipeFlask Culture, yaitu • Thick Clot Culture, sangatbaikuntukpertumbuhan yang cepatdarisuatukulturjaringan • Thin Clot Culture, sangatbaiksebagaiujipengaruhmakananpada medium terhadapkultur.
MekanismeKulturSelHewan • Menyiapkanperalatankultur . • Mencuci organ ataujaringandidalam PBS • Organ dicincangsampaihalusdenganguntingdanpinset . • Dicucikembalidengan PBS • Dipindahkandalambotolsteril • PenambahansenyawaTripsinuntukmenghancurkan organ • Cairandipindahdalambotolsteril • Organ yang belumhancurditripsinasiulangdancairan yang terkumpuldisaring, disentrifugasi . • Supernatandibuang, diganti MEM, diinkubasi . • Setelah 2-3 hari, biakansel yang sudah monolayer dapatdiperbanyakdengancarapasase .
PembuatanKulturJaringanHewandenganMenggunakan Media Alami • Mensterilkan Laminar Air Flow danruangandengansinar UV, 2 jam. • Menyiapkanalat yang telahdisterilkan (spet; membranmilipore; botolkaca ; aluminium foil; pembakarspiritus) • Menyiapkanbahan (darahayamsegar yang diberiamoniumoksalatsebagaiantikoagulan; alkohol 70%; spirtus) • Mensentrifugedarah (plasma darah (bag atas) danseldarah (bag bawah). • Menempelkanmembranmiliporepadamulutbotoldenganbantuanspetsecaraaseptik. • Menyaring plasma darahkedalambotolmelaluimembranmilipore. • Setelahsemua plasma darahtersaringkedalambotol, lalumengambilmembranmiliporedanmenutupbotoldenganpenutupnya. Kemudianditutuplagidenganaluminium foil.
KulturMesenchymal Stem Cells (MSCs) dari 3 macamjaringan (amandel, adiposa, sumsumtulang) menjadibanyakmacamsel (ototpolos, osteosit, kondrosit, saraf, danlemak)
Kulturjaringanepitelususembrioayam
Pengaturanpelepasan growth factor untukregenerasijaringan • Pelepasan GF diperlukanuntukpembentukanjaringanbaru, misaljaringanpembuluhdarahdarimiokardium • GF untukpembuluhdarah : basic fibroblast growth factor (bFGF)
Kulturjaringantulang • Pertumbuhandandiferensiasiosteoblastdarimesenkim stem cell akandistimuliolehkontakinterseluler, faktor media (microenvironment) , stimulasifisik, danbentukpermukaansel/jaringan
Bentukpermukaansel/jaringantulangtergantungpadakomposisisenyawapenyusunmatriksekstraseluler (protein, polisakarida, growth hormone) • Pertumbuhanselterjadikarenaadanyainteraksiantarakontakreseptordenganmatrikekstraseluler
Implantasi : strategipotensialuntukmemfasilitasiregenerasijaringantulang yang rusakkarenapenyakit, trauma • Cetakanpenggantitulangterbuatdaribiokeramikpolimer, bahanlogam, dankomposittulang • Keberhasilanregenerasidansistemvaskularisasijaringantulangditentukanolehkesesuaiandngcatakannya
Deteksi stem cell (selinduk) yang ditransplantasikankejaringan lain menggunakanmetodepencitraan (magnetic resonance imaging , MRI)
Metodekulturjaringankulit
Kulturjaringankulit • Digunakanuntuktransplantasikulitbabikekulitlukabakar • Alternatif lain menggunakanbahankolagensapi, kolagentulangrawanikanhiu
Manfaatteknikkulturjaringankulitdalamoperasiplastik, cream anti-aging, dll
Jaringankulitdiambildaripasiendandikulturkandalamcawanpetri
KelebihanPenelitianmenggunakanKulturSelHewan • Mudahdikontrolfisikokimialingkungannya (pH, suhu, tekananoksigen, dan CO2) • Pengambilankesimpulanrelatiflebihmudahdenganmenggunakanpopulasisel yang homogen . • Kultursel primer tetapmemilikiintegritasmorfologidanbiokimiawidalamjangkawaktu lama, dengandemikianmemungkinkanmelakukanpenelitianulang (reproducible) danterkontrol . • Ekonomis, tidakperlumemakaibanyakhewancoba . KekuranganKulturSelHewan • Memerlukankeahlian, selalumenjagaaseptis, tertibdansabar . • Gambaranhistologissudahtidaknampak . • Dalamkasuskulturseltelahmengalamiperubahansifataslinya, makahasilpengamatan yang diperolehakanmenyimpang . • Tidakadapengaruhsistemikdankerjasamaantar-sel yang berbedadalamsuatujaringan yang kemungkinanmemegangperanpentingdalamaktivitasfisiologis .
