1. Hepatit B Hepatit C TTV Virüs ENFEKSİYONLARININ TANISINDA PCR KULLANILMASI

2. PCR nedir? • Canlılarda bulunan özgün genetik parçacıkların enzimatik olarak çoğaltılmasıdır. Kullanılan enzim “polimeraz” enzimidir. PCR DNA polimerizasyon işleminin belli özel amaçlar için minik deney tüplerinde (PCR tüpleri) veya cam borucuklarda yapılan bir kopyasıdır. • Canlı hücreler içindeki polimerizasyon işlemi, PCR tüpleri içinde, gerekli tüm kimyasal maddeler konularak ve sıcaklık parametreleri uygulanarak taklit edilmektedir.

3. PCR; 94 °C-98 °C denatürasyon 37 °C-65 °C annealing 72 °C ‘ de extension bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.

4. PCR hangi hastalıkların tanısında kullanılır?

5. Bakteriyel infeksiyonlar • Salmonella (Tifo ve Paratifo), • Mycoplasma (CRD-MG, InfectiousSynovitis-MS, M.iowae, Infectioussinusitis-hindi-MM): , • Tavuk Kolerası (Pasteurellamultocidae) • İnfeksiyözKoriza (Haemophilusparagallinarum), • Tuberculosis (Mycobacteriumavium), • ORT (Ornithobacteriumrhinotracheale)’

6. Viralinfeksiyonlar • LökosisVirus’ları (ALV ve ALV-J), • Tavuk İnfeksiyöz Anemi Virusu (CIAV), • InfeksiyözLaringotrakeitisvirusu (ILTV) • Marek Hastalığı Virusu (MHV), • NewcastleHastalığıVirusu (NDV), • InfeksiyözBursal Hastalığı Virusu (IBDV-GumboroVirusu), • İnfeksiyözBronşitisVirusu (IBV), • Reovirus, Kanatlı İnfluenzaVirusu (AvianİnfluenzaVirusu), • TurkeyRhinotracheitisVirusu (TRTV)

7. Hepatit B • Hepadnaviridae ailesinden ortohepadnavirus cinsinde sınıflandırılmaktadır. • Küçük bir DNA virüsü olup sadece insanları enfekte eder. • Karaciğere etki etmekle birlikte lenf bezleri , periferik kan mononükleer hücreleri , dalak ve kemik iliğini de tutabilir . • HBV , Kronik hepatit , siroz ve hepatosellülerkarsinomaya yol açar ve yıllık bir milyon ölüme neden olmaktadır.

8. Hepatit B Etiyoloji açıdan ; • HBV ile enfekte kişilerin serumlarının incelenmesi ile 3 farklı morfolojide partikülün varlığı gösterilmiştir. • Sayıca fazla olan partikül küçük pleomorfik yuvarlak ortalama 20 nm büyüklüğünde bulaştırıcı olmayan • Aynı çapta , ancak farklı uzunlukta tübüler veya filamantöz partiküller • Ve üçüncü olarak hepatit B virüs veya tam bir virion olan , yaklaşık 42-47 nm çapta , çift kılıflı yuvarlak partiküllerdir . Bu viriona yani kompletenfeksiyöz virüse ‘Dane’ partikülü denir.

9. Hepatit B Etiyoloji açıdan ; • Viralreplikasyon tamamlanmadan DNA moleküleri virion içinde paketlenmektedir. • HBV-DNA’ sı üzerinde virüsün antijenlerini kodlayan 4 gen (S , C , X , P) bulunur. Bunlar faklı proteinlerin şifrelenmesinde rol alır . • C geninin pre-C ve C denen iki bölgesi vardır . • P geni polimeraz ve endonükleaz enzimlerini kodlar . • Pre –C ve C üzerindeki mutasyonlar kronikleşmede ve tedaviye yanıtsızlıkta önemli rol almaktadır .

10. Hepatit B Epidemiyoloji açıdan; • Dünyada yaygın bir enfeksiyondur.yaklaşık iki milyar kişi HBV ile enfektedir. • HBV ’ nin en yoğun olduğu vücut sıvıları sırasıyla kan,semen ve vaginalsekresyonlardır. Bu sıvılarla bulaşma riski daha fazladır. Ayrıca tükürük,ter,gözyaşı, süt gibi sıvılardada potansiyel olarak enfeksiyözdür.

11. Hepatit B bulaşma ; • Kan ve kan ürünleri nakli,ortak enjektör kullanımı, enfekte kişiyle cinsel ilişki, taşiyıcı anneden bebeğine transplasental yolla,perinatal dönemde anne sütü ile bulaşabilir. • Bu yolların saptanmadığı durumlarda horizontal bulaş söz konusudur . Mekanizması tam bilinmemekle birlikte kan, tükürük gibi sıvıların ciltle teması sonucu olduğu kabul edilmektedir.Özellikle aile içi bulaş bu şekilde gerçekleşmektedir.

12. Hepatit B Patogenez açıdan; • Virüs karaciğer hücrelerinde DNA polimerazı yardımıyla çogalır. Ayrıca pankreas,kemik iliği hücreleri,lenfositlerdede çoğalır. • Akut HBV enfeksiyonu sırasında farklı tipte antijenlere karşı sıvısal ve hücresel tipte bağışık cevap oluşur. • Kontrol altına alınmasında immum yanıt önemlidir. • Viral DNA’nın konak DNA’sına integre olması,virüsün mutasyonlar oluşturabilmesi,immum yanıtı değiştiren viral proteinlere sahip olması gibi nedenlerle virüs immum yanıttan kaçabilmekte ve kronikleşebilmektedir.

13. Klinik Belirti ve Bulgular • HBV ’ nin seyri başlıca 4 evreye ayrlmaktadır. • Viralreplikasyonun yüksek olduğu immum tolerans dönemi, • İnflamatur yanıt ve hücre hasarının oluştuğu immünolojik yanıt dönemi, • Genom integrasyonunun olduğu viralreplikasyonun baskılandığı dönem, • HBsAg’ nin negatifleştiği ve antikorların meydana geldiği immün dönem.

14. Akut HBV Enfeksiyonu Sessiz (belirtisiz,inaparan,asemptomatik) hepatit ile sarılıksız (anikterik) terimleri ile ifade edilir. • Sessiz(asemptomatik) hepatit: Hastalarda ne semptom ne de sarılık vardır . Bu olgular ancak serolojik veya biyokimyasal testlerle tanınabilir. Genel olarak yaş ilerledikçe kronikleşme azalır fakat semptom görülme şansı artar. • Semptomatik akut viral hepatit: Sarılıksız ve sarılıklı semptomatik hepatitlerin seyirleri arasında fark yoktur. Bütün hepatitler için geçerli dört dönem (inkübasyon dönemi,prodromal dönem,ikterik dönem ve iyileşme dönemi) aynıdır.

15. Kronik HBV Enfeksiyonu • Alınan bir HBV enfeksiyonundan sonra hastalığın kronikleştiğinin kanıtı genellikle HBsAg’nin serumda altı aydan fazla bir süre kalmasıdır. • Kronikleşmenin nedeni tam bilinmemektedir. • Erkekler kadınlara göre en az iki misli daha fazla kronikleşme göstermektedir.Bunun sebebi tam olarak bilinmemekle birlikte ,virüsün genomunda glikokortikoidlere hassas bölgenin bulunduğu gibi cinsiyet steroidlerine de hassasiyetin var olabileceği düşünülmektedir.

16. HBV’nin Kronikleşmesi • Karaciğer fonksiyon testleri normal ,kliniği olmayan ,karaciğer patolojisi normal olan kişiler için ‘taşıyıcı’terimi kullanılır.Daha sonra karaciğer fonksiyon testlerinde bozulma ve biyopside tipik patolojik değişikliklerle karakterize kronik persistan hepatit (%70) ve kronik aktif hepatit (%30) tabloları gelişebilir. Kronik enfeksiyon sonrasında siroz ve hepatosellüller kanser gibi ciddi klinik tablolar gelişebilir.

17. HBV Tanı • Nonspesifik Testler • Spesifik Testler

18. Nonspesifik Testler • İlk yapılacak laboratuvartetkidi : İdrarda bilirubin tayini ve serumda total ve direkt bilirubin ölçümleridir. Çoğunlukla serum bilirubin değerleri 10 mg/dl altındadır.bazen 20 mg/dl ’ yi aşan değerlere rastlanabilir.Bir iki hafta içinde bilirubin değerleri en üst düzeye ulaştıktan sonra yavaş yavaş azalır ve genellikle altı haftada normale iner.İyileşme döneminde serum ve idrar bilirubin değerleri arasında diskordans görülebilir.Bu durum muhtemelen serumdaki konjugebilirubininirreversibl olarak albumine bağlanması ve idrarla atılamamasından kaynaklanmaktadır.

19. Nonspesifik Testler • Serum alanin ve Aspartataminotransferaz (ALT , AST) değerleri karacigerdeki hasarın hakkında fikir verir fakat hastalığın seyri hakkında bir gösterge değildir. • ALT primer olarak karaciğerde bulunur ve stoplazmada yerleşmiştir . AST ise adele,akciğer gibi dokularda da bulunur . ALT 400 IU/I üzerine çıktığı zaman hemen daima akut hepatiti veya akut alevlenmeleri düşünmek gerekmektedir. • Toksit veya ilaca bağlı hepatitlerde de yüksek transaminaz değerlerine rastlanır. Bu durumlarda genellikle AST/ALT oranı daha yüksek bulunmaktadır.

20. Nonspesifik Testler • Toksit veya ilaca bağlı hepatitlerde de yüksek transaminaz değerlerine rastlanır. Bu durumlarda genellikle AST/ALT oranı daha yüksek bulunmaktadır • Karaciğer kanserlerinde , granülomatöz hepatitlerde , infeksiyözmononükleoz gibi hastalıklarda alkalenfosfataz fazlasıyla yüksek bulunur.

21. Spesifik Testler • Antijen ve Antikor Arama : Rutinde tanı için en sık serolojik testler kullanılır ve hasta serumda HBV’ ye ait antijen ve antikorlar araştırılır . Bu amaçla farklı duyarlılık ve özgüllükte serolojik testler geliştirilmiştir. • Yaygın olarak kullanılan ve duyarlılık/özgüllüğü en yüksek olanlar RIA ve EIA’ dır. Bu yöntemlerle kanda 0.25-0.5 ng /mL HBsAg ve 1 mIU/ mL anti-HBs saptanabilir. • Serumda HBsAg’ nin varlığı akut veya kronik enfeksiyon olsun ,aktif enfeksiyonu gösterir.

22. Spesifik Testler • Tipik HBV enfeksiyonunda ALT düzeyi yükselmeden 2-4 hafta ve klinik belirtileri veya sarılığın ortaya çıkmasından 3-5 hafta önce HBsAg kanda saptanabilir. • Akut HBV enfeksiyonunun seyrinde HBsAg olumluluğunun süresi değişkendir , 6 aydan fazla devam etmesi kronikleşmenin göstergesidir . • HBsAg olumlulaşmasının hemen ardında HBeAg’ de pozitifleşir. HBeAgviral partiküllerin , HBV DNA’ nın ve DNA polimerazın varlığını gösterir. HBeAg’ nin kaybolması ve anti-HBe’nin pozitifleşmesi iyileşmeye gidişin bir kanıtıdır.

23. Spesifik Testler • Klinik olarak hasta kişilerde HBsAg olumluluğunda hemen sonra , kural olarak total anti-HBcde pozitifleşir. • Anti-HBcIgM’nin yüksek titreleri(>1/1000) akut enfeksiyon göstergesidir. Bu yüksek titre , akut enfeksiyonu iyileşmesi veya kronikleşmesi ile düşer. • Bir kişinin HBV ile maruziyetini belirlemede ilk olarak HBsAg , anti- HBs ve anti-HBc göstergeleri istenmelidir.

24. Spesifik Testler • Nükleik Asit Araştırılması: Ayrıca gelişmiş laboratuvarlarda çoğu kez araştırma ve/veya sağaltımın izlenmesi amacına yönelik olarak insan serum ve dokularında HBV–DNA dotblothibridizasyon , insan serumunda kantitatif HBV-DNA sıvı faz hibridizasyon yöntemleriyle saptanabilmektedir. • Yine insan serumunda HBV-DNA dallanmış-branc-hed-DNA sinyal amplifikasyon yöntemi ile kantitatif olarak saptanabilir.

25. Spesifik Testler • Son zamanlarda serumda HBV-DNA’yı kalitatif ve kantitatif olarak saptamaya yönelik çok duyarlı PCR yöntemleri geliştirilmiştir. • Bu yöntemler sayesinde serumda 10 kopya HBV-DNA/ml saptanabilmekte ve de duyarlılık dotblothibridizasyondan 100-1000 kez fazla olmaktadır .

26. HBV Tedavi • Akut enfeksiyonun tedavisi yoktur. Semptomatik tedavi uygulanır. • Kronik hepatit B tedavisinde uygulanması için FDA onayı alan ilaçlar interferon-a2b , lamivudin ve adefovirdir. • Tedavi sırasında ilaca karşı direnç(YMDD) gelişebilir. • Bu nedenle hastaların izlemi önemlidir.

27. Hepatit C

28. Hepatit C Etiyoloji açıdan ; • Etken(HCV) flaviviridae ailesinde yer alan pozitif sarmallı zarflı bir RNA virüsüdür. • HCV genomunun konak kromozumuna entegre olduğunu gösteren bir kanıt yoktur. • HCV hücre kültürlerinde replike olamaz . • RNA’ ya bağımlı RNA polimerazınreplikasyon sırasında oçuşan yanlış okumaları düzeltme mekanizması yoktur. Bu nedenle viralreplikasyon sonrasında mutasyonlar meydana gelir.

29. Hepatit C Etiyoloji açıdan ; • Yeni enfekte olan kişilerin bile karaciğer ve serumunda ki viral genomların %85’inde genetik varyantlar saptanır.Enfekte hastalarda quasispecies (türümsü) olarak adlandırılan birbirine çok benzemesine karşın genetik dizi farklılıkları gösteren HCV’ler meydana gelir. • Şimdiye kadar HCV’nin altı farklı genotipi (1a,1b,2,3a,4 ve 6) belirlenmiştir.Bunlardan genotip 1b tedaviye en kötü yanıt veren genotiptir. • Ülkemizde en çok genotip 1b görülmektedir.

30. Hepatit C Epidemiyoloji; • Batı ülkelerindeki en sık siroz nedenidir ve hepatit C taşıyıcı sayısı dünyada 200 milyondur. Ülkmizde ise batı ülkelerine yakındır . • Parenteral geçen nonAnonB hepatitlerin en sık nedenidir. • Daha az oranda olmak üzere vertikal ve cinsel ilişkiyle de bulaşabilir. Tam olarak tanımlanamamış bulaş yollarıda vardır.

31. Hepatit C Patogenez; • HCV enfeksiyonunda oluşan karaciğer hasarının oluş mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte , bu durumun virüsün sitopatiketkisinden çok , virüse özgü sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonu ile başlayan immünolojik olaylara bağlı olarak geliştiği düşünülmektedir.

32. Hepatit C Klinik Belirti ve Bulgular; • Akut HCV enfeksiyonun inkübasyon süreci 6-8 haftadır. • Hepatit B’ ye göre daha hafif bir hepatite neden olur. Anikterik seyretme olasılığı da daha fazladır , bu nedenle hastalığı akut dönemde yakalamak zordur. • Viralhapatit B’ ye göre bilirübin ve transaminaz artışı daha hafiftir .

33. Hepatit C Klinik Belirti ve Bulgular; • Kronik HCV enfeksiyonunun virüsle karşılaşmayı takiben hastaların %70-80’i kronikleşir.kronikleşen olguların %25’ inde karaciğer hasarı hafif düzeyde kalır ciddi bir ilerleme olmaz. Bunlara ‘asemptomatik HCV taşıyıcısı’ denir. • Kronikleşen diğer olgularda ise HCV RNA’ nın pozitif olduğu ve transaminasların yüksek olduğu kronik hepatit tablosu gelişir. Kronik HCV yavaş , fakat karalı bir progresyon gösterir.

34. Kronikleşme Riskini Artıran Faktörler • Parenteral bulaşma (damar yolundan) • Çok sayıda kan nakli öyküsü • Profesyonel donör kanı ile transfüzyon • Akut dönemde ciddi semptomlar • Akut dönemde yüksek serum ALT (SGPT) seviyesi • Yüksek titrede anti-HCV pozitifliği • Erkek cinsiyet • 40 yaş üstü

35. Hepatit C Tanı • Kesin tanı serolojik testlerle konulur.ELİSA ile HCV spesifik lgG(anti-HCV) araştırılması pratikte en yaygın kullanılan testtir. Yanlış pozitiflikten kuşkulanıldığında RIBA(radyo immunoblotassay) ile doğrulama testi yapılabilir. • Anti-HCV enfektiviteyi değil virüsle karşılaşmayı gösterir. Akut, kronik ve iyileşmiş enfeksiyonları ayırt edemez.

36. Hepatit C Tanı • Aktif enfeksiyonu saptamak için HCV-RNA’nın saptanması gerekir. • Transaminaz yüksekliği, RIBA pozitifliği, akut hastalığın üzerinden 6 ay geçmesine rağmen HCV-RNA’ nın saptanması kronikleşmeyi gösterir. • Son yıllarda tedavi takibinde PCR ile viral yük tayini kullanılmaktadır.

37. Hepatit C Tedavi • Yapılan çalışmalarda akut hepatit C’ de interferon monoterapisini veya ribavirinle birlikte kullanılmasının kronikleşme oranını azalttığı gösterilmiştir. • Kronik hepatit C’ de ise sürekli ALT yüksekliği saptanan ve biyopside anlamlı nekroinflamatuar aktivite saptanan olgulara antiviral tedavi başlanır.

38. Hepatit C Korunma • HCV enfeksiyonundan korunma amacıyla kullanılabilecek bir aşı ve immünoglobülin yoktur.

39. "Transfusiontransmittedvirus" (TTV) • TransfusionTransmittentVirus (TTV) : hepatitli bir hastanın serumundan izole edilen yeni bir DNA virüsüdür . • Daha sonra bu virüsün nükleotid dizilimi tama yakın belirlenmiş ve serumda virüsü saptamak için duyarlı (PCR) yöntemi geliştirilmiştir. • TT virüsünün diğer hepatit virüslerinin varlığı ile yada kantransfüzyonu veya karaciğer hasarı ile ilişkisinin olmadığı kanısına varılmıştır.

40. "Transfusiontransmittedvirus" (TTV) • TTV kılıfsız, halkasal yapıdadır ve tek iplikli DNA dan oluşan bir virüstür. • TTV tek başına hepatite sebep olmamakla beraber fulminan hepatit hastalarının %46 sında ve etiolojisi bilinmeyen kronik karaciğer hastalarının %47 sinde TTV bulunduğu tespit edilmiştir. •  cinsel yolla, anneden çocuğa ve diğer yollarla bireylere bulaşmaktadır. Bununla beraber tükürükte, boğaz salgısında, gözyaşında, anne sütünde ve saç derisinde TT virüsüne rastlanmıştır.

41. TT Virüs Tanı • TTV’nin tespiti için SDS-PAGE ve immuno-blotlama teknikleri kullanılmaktadır. • Aynı zamanda TTV tanısı için PCR temelli testlerden yararlanılmaktadır.

42. PCR'ın avantajları ve  dezavantajları  1. Doğrudaninfekte eden organizmayı belirler. 2. Antikor tespiti gibi dolaylı yolları kullanmaz. 3. Erken teşhis imkanı sunar. 4. Mikroorganizmayı yüksek sensitivite (duyarlılıkla) ve spesifite (kesinlikle) ile tespit eder. 5. Mikroorganizmanın düşük konsantrasyonlarında bile hassas tanı sağlar. 6. Kültüre edilemeyen veya yavaş büyüyen mikroorganizmaların tespitini sağlar. 1. Pahalıdır. 2. Yüksek teknoloji gerektirmektedir. 3. Uzmanlaşmış merkezlerde yapılmaktadır. 4. Hastalığın bugünkü durumu hakkında bilgi vermektedir.

43. Moleküler Biyolog BAHAR KARTAL Teşekkürler =)