Tema 9. Sistemas de modificación celular

1. Tema 9.Sistemas de modificación celular Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

2. Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes. • Ácidos nucleicos • ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,… • ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o antisense) • Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo) • Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína

3. ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula? • Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica) • Caracterizar la función de la proteína de interés • Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) • Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) • Obtener proteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero

4. Condiciones ideales de introducción del ADN • El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente • Eficiencia máxima • Toxicidad nula

5. Estrategias de introducción de ADN • Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos • Vector: plásmido de expresión • Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales • Vector: material genético del virus

6. Amplificación del vector en bacterias Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables Transfección: vector Componentes de un plásmido de expresión de células de mamífero: • Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN • Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido • Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva) • Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés) • Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero) • Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina).

7. Vector de expresión para células de mamífero MCS: multi cloning site Seq. de poliadenilación Promotor Promotor Gen de resistencia a la neomicina (selección en céls. mamífero) Para amplificación y selección en bacterias Seq. de poliadenilación http://www.invitrogen.com

8. Genes marcadores o “reporter” Codifican para proteínas de fácil detección Permiten: Controlar la eficiencia de entrada del ADN Estudiar la regulación de la expresión de un gen Monitorizar la localización subcelular de la proteína Aplicaciones: Normalización de los ensayos de expresión Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter Optimización de la metodología de introducción del ADN

9. Genes “reporter” más comunes • Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía. • Luciferasa (luc) • Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro. • -galactosidasa (-gal or lacZ) • Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan.

10. Genes “reporter” más comunes • Green fluorescent protein (GFP) El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo. La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria. La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto. En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales Nuevas proteínas fluorescentes disponibles: AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1.

11. Métodos de Transfección • Métodos químicos: Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o “carrier”) • Métodos físicos: Introducción del ADN de forma directa

12. Métodos de Transfección • Métodos químicos: • Coprecipitación con fosfato cálcico • DEAE-dextrano • Lípidos catiónicos • Polyethylenimine (PEI) • Métodos físicos: • Electroporación • Microinyección • “Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun” • Magnetofección

13. Barreras que tiene que superar el ADN http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html • La eficiencia de transfección depende de la superación de varias barreras: • adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y entrada del complejo en la célula (membrana plasmática) • liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación lisosomal • translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el núcleo

14. 1.Métodos químicos • Coprecipitación con fosfato cálcico: precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula ADN + CaCl2 Añadir Na2PO4 en tampón Precipitados de CaPO4 con ADN endocitosis

15. 1. Métodos químicos • DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano):complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

16. 1. Métodos químicos • Lípidos catiónicos:los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas Este método recibe el nombre de Lipofección

17. Protocolo de Lipofección

18. 1. Métodos químicos Lípidos catiónicos: Altaeficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares Gen marcador: -galactosidasa

19. 1. Métodos químicos • PEI (polyethylenimine):Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

20. 1. Métodos químicos Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293 PEI Lípidos catiónicos Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

21. 1. Métodos químicos Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent

22. Factores que pueden influir en la eficiencia de Transfección • Presencia de antibióticos • El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad • Presencia de suero • El suero puede disminuir la eficiencia de transfección • Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más tóxico para las células

23. 2. Métodos físicos • Microinyección:consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula • Biolístico (biological ballistics):implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio. • Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular • Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células

24. Microinyección • Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio.

25. Microinyección Limitaciones • Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados) • Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo) • Seguimiento individual de cada célula microinyectada • Aplicaciones más corrientes: • Microinyección de células adherentes en cultivo • Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto) • Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

26. Biolistic particle delivery • Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN. Helios Gene Gun - BioRad Aplicaciones: Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales

27. Electroporación Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática. • Ventajas: • Técnica simple, reproducible y de gran eficacia • Desventajas: • Requiere desenganchar las células del sustrato • Mucha mortalidad celular • Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular

28. Electroporación Parámetros: • Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm) • Longitud del pulso (de seg a mseg) • Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60% • En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo.

29. MagnetofecciónMATra - Magnet Assisted Transfection Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.

30. Tipos de transfección • Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula. • Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000). http://www.promega.com/guides/transfxn_guide/transfxn.pdf

31. Transfección transitoria vs. Transfección estable Transfección transitoria • Ventajas • Elevado nivel de expresión • Es fácil co-expresar varias proteínas • Procedimiento fácil y rápido Inconvenientes • Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea) • Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal) • Requiere gran cantidad de plásmido Transfección estable Ventajas • Población celular homogénea (clonal) • Producción continua de proteína (teóricamente) • Almacenamiento de células expresoras del transgen Inconvenientes • Integración del transgen al azar en el genoma celular • Niveles de expresión moderados • Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas • Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

32. Clones estables: procedimiento de obtención Transfección 1/10000 céls. 2 días Adición antibiótico 1-2 semanas Muerte masiva células no estables 2 semanas Se cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen Colonias de células estables Se tripsinizan individualemente 2 meses 1 mes

33. Clones estables: selección con antibiótico Sin selección Con selección muerte de células no expresoras aparición de clones resistentes crecimiento de los clones estables • Cassettes de resistencia: • NEO: Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml) • HYG: Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml) • PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml) • Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica

34. Tema 9.Sistemas de modificación celular Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

35. Transducción: vectores virales • Adenovirus • Retrovirus • Lentivirus • Herpes virus • Adeno-associated virus

36. Vectores virales: Adenovirus • Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común) • Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5’ (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb • Simetria icosahédrica (80-100 nm diámetro) • Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

37. Vectores virales: Adenovirus Ciclo del Adenovirus • Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibra • Endocitosis del virus • Sale del endosoma y transloca al núcleo • El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción • La transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

38. Vectores virales: Adenovirus Genoma del Adenovirus Se transcriben las dos cadenas de ADN Transcripción en dos fases: Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN) Late: (después de la replicación del ADN)

39. Vectores virales: Adenovirus Vector Adenoviral • Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped). • El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X) • Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

40. Vectores virales: Adenovirus Ventajas • Infectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficiencia • Infectan tanto células en división como células que no se replican • Elevados niveles de expresión de la proteína • Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica) • El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico) • Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala) • Sistema homólogo para genes humanos

41. Vectores virales: Adenovirus Inconvenientes • Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb) • Expresión transitoria de la proteína Aplicaciones • Transducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínas • Obtención de proteína recombinante por sobre-expresión en células humanas • Terapia génica “in vivo”

42. Retrovirus Oncoretrovirus (retrovirus) ej. Moloney Murine Leukemia Virus Sólo infectan células en división Lentivirus ej. HIV Infectan tanto células en división como quiescentes

43. Vectores virales: Retrovirus • Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA) • Codifica por una transcriptasa reversa (RTase: RNA-dependent DNA polymerase) • Sólo infecta a células en división • Se integra en el genoma de la célula

44. Vectores virales: Retrovirus Ciclo del retrovirus Infección célula diana Genoma RNA  copia DNA  transporte al núcleo Integración del ADN al cromosoma Transcripción DNA viral  mRNA Traducción mRNA  gag, pol, env Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase Partículas virales liberadas

45. Vectores virales: Retrovirus Construcción Vector Retroviral • ¿Qué es imprescindible? • 5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA) • señal de empaquetamiento • No se necesita: • gag, pol, env estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada para la producción de los viriones

46. Genoma retroviral Vector retroviral Promotor Gag- proteínas estructurales internas de la cápside Pol- Rtase, integrasa, proteasa Env- proteínas de la cápside Promotor Tamaño máximo del inserto  8kb Vectores virales: Retrovirus Construcción Vector Retroviral

47. Vectores virales: Retrovirus Obtención de los Retrovirus Producción de los retrovirus Línea celular empaquetadora

48. Vectores virales: Retrovirus Ventajas: • Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma) • Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos) Inconvenientes: • Limitación tamaño inserto ( 8 kb) • Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus • No infecta células que no se repliquen • La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercional Aplicaciones: • Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estable • Terapia génica “ex vivo”

49. Lentivirus