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ELECTROFORESIS

Electroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico. ELECTROFORESIS. Cátodo. -. +. -. +. Ánodo. ELECTROFORESIS. Cátodo. q. -. Velocidad = E. f. +. -. E: gradiente de potencial. E=V/d q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH)

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Presentation Transcript

  1. Electroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico ELECTROFORESIS Cátodo - + - + Ánodo

  2. ELECTROFORESIS Cátodo q - Velocidad = E f + - E: gradiente de potencial. E=V/d q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH) f: coeficiente de fricción tamaño forma + Ánodo

  3. Criterios de separación electroforética Cátodo q (carga) - Velocidad = E f (tamaño, forma) + - • Separación por tamaño • Separación por carga • Separación por tamaño y carga + Ánodo

  4. ELECTROFORESIS Cátodo q (carga) - Velocidad = E f (tamaño, forma) + - • Muestra • Tampón: mantenimiento de pH y conductividad • Soporte • Equipo electroforético: • Fuente de alimentación • Cubeta de electoforesis + Ánodo

  5. SOPORTES ELECTROFORÉTICOS Cátodo • Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937) • En solución. Difusión, convección. • Electroforesis de zona • Soportes no restrictivos • Papel, acetato de celulosa • Almidón, agar, agarosa • Soportes restrictivos • Agarosa (ácidos nucleicos) • Poliacrilamida - + - + Ánodo

  6. EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS Cátodo - + - + Ánodo

  7. Carga eléctrica de la biomoléculas • Ácidos nucleicos • Proteínas

  8. Enlace fosfodiéster Lehninger. Principios de Bioquímica

  9. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

  10. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa DNA viral DNA genómico RNA

  11. ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R)) Lab-on-a-Chip: electroforesisminiaturizada y automatizada

  12. ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))

  13. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa DNA viral DNA genómico RNA

  14. Criterios de separación electroforética Cátodo q (carga) - Velocidad = E f (tamaño, forma) + - • Separación por tamaño • Separación por carga • Separación por tamaño y carga + Ánodo

  15. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa • DNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes • Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE) • Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol • RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes • Tampón: MOPS + formaldehído • Muestra: Formamida, Azul de bromofenol

  16. Topología del DNA Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la calle 1. a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA de cada banda? b) A continuación se incubó el DNA con topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA corresponde cada banda? c) Otra muestra se incubó durante 30 min con topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de encontrar más DNA de las formas de movilidad reducida?

  17. Electroforesis de DNA en geles de agarosa SSCP: single-strandconformationpolymorphism

  18. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE(PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamaño • pulsed field gel electrophoresis • FIGE: field inversion gel electrophoresis • TAFE: transverse alternating field electrophoresis • RGE: rotating gel electrophoresis • CHEF: Contour-clamped homogeneous electric field

  19. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE(PFGE) Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA Schizosaccharomycespombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose (Clontech), 10 C.

  20. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE(PFGE) Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomycescercevisiae chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible

  21. Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot gel Nitrocelulosa

  22. Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot • Transferencia a nitrocelulosa o nylon • Hibridación con sonda específica radiactiva • Lavado y autoradiografía Autoradiografía Electroforesis DNA

  23. Southern blot: RFLPPolimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción Electroforesis DNA genómico Autoradiografía (B) (A) SONDA EcoRI EcoRI EcoRI (A) (B) EcoRI EcoRI

  24. Hibridación de ácidos nucleicos: Northern blot Electroforesis RNA Autoradiografía

  25. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL SUERO EN ACETATO DE CELULOSA Soporte no restictivo: Separaciónporcarga

  26. ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN ACETATO DE CELULOSA • Anemia falciforme: • Mutación en hemoglobina A • Mutación GAG -> GTG • Glu -> Val

  27. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE)

  28. Gel de empaquetamiento (3% PA) Gel de separación (8-20% PA) Soporterestrictivo: Separaciónportamaño

  29. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE) • Concentración de poliacrilamida • Homogénea • Gradiente • Tampón de muestra • Reductor (2-mercaptoetanol) • No reductor • Detección de lasproteínasseparadas • Tinción (AzulCoomassie, sales de plata) • Fluorescencia • Inmunodetección

  30. ISOELECTROENFOQUE

  31. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

  32. ELECTROFORESIS CAPILAR • Electroforesiscapilar de altaresolución (HPCE) • Soporte: capilar 7-100 cm, 20-200 micras de diámetro • Voltaje: >500 V/cm • Automatizada, granresolución • Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …

  33. ELECTROFORESIS CAPILAR • CZE: de zona. Mediolíquido, homogéneo, capilares con cargauniforme • CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal, metilcelulosa. • CIEF: Isoelectroenfoquecapilar. • Isotachophoresis (ITP). • Electrokinetic Chromatography (EKC). • MicellarElectrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC. • Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC). • Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE). • Capillary Electrochromatography (CEC.

  34. Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado Oligo: 5´--C T T A A - Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´ - DNA polimerasa - Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP -Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP Separación de los fragmentos de DNA marcados, mediante electroforesis capilar 5´--C T T A A G -3´ 5´--C T T A A G C -3´ 5´--C T T A A G C G -3´ 5´--C T T A A G C G A -3´ + Detector de fluorescencia 5´--C T T A A G C G A T -3´ láser 5´--C T T A A G C G A T T -3´ G C G A T T A C G . . . 5´--C T T A A G C G A T T A -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´

  35. CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE FUERZA CENTRÍGA RELATIVA • ¿A quéfuerzacentrífugarelativaequivalen, en un rotor de 10 cm de radio, lassiguientesvelocidades de giro? • 1.000 rpm • 10.000 rpm • 30.000 rpm • 100.000 rpm

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