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ELECTROFORESIS Cuál de los siguientes enunciados es verdadero?

ELECTROFORESIS Cuál de los siguientes enunciados es verdadero?. La velocidad que adquiere una partícula que porta una determinada q es proporcional al E aplicado. La m e de una proteína es directamente proporcional a la M r e inversamente proporcional a la q.

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ELECTROFORESIS Cuál de los siguientes enunciados es verdadero?

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Presentation Transcript

  1. ELECTROFORESISCuál de los siguientes enunciados es verdadero? • La velocidad que adquiere una partícula que porta una determinada q es proporcional al E aplicado. • La me de una proteína es directamente proporcional a la Mr e inversamente proporcional a la q. • La FEO es proporcional al E aplicado en el sistema. • En un fraccionamiento electroforético de proteínas de suero humano, el poder resolutivo del agar resulta mayor que el de una membrana de acetato de celulosa gelificado. • La FEO es siempre indeseable en el desarrollo de las distintas técnicas electroforéticas. • El desarrollo de calor es siempre indeseable en electroforesis. • La movilidad de una partícula en electroforesis es directamente proporcional a la fuerza iónica del medio.

  2. Rango de separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida

  3. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

  4. ESTRUCTURA DE LA MATRIZ DEL GEL DE POLIACRILAMIDACopolimerización de los monómeros de acrilamida y N,N’- metilenbisacrilamida

  5. PAGE. POLIMERIZACION Reacción de catálisis por radicales libres: • Iniciador: persulfato de amonio • Catalizador o propagador de la reacción: TEMED (N,N, N’, N’-tetrametilendiamina (acelera la formación de radicales libres del iniciador) S2O82- + e- SO42- + SO4-• (R•) R• + M  RM• RM• + M  RMM • , etc • Iniciador: riboflavina + UV (reacción fotoquímica)  generación de R• • TEMED no es imprescindible pero favorece la reacción

  6. PAGE. POLIMERIZACION • MONÓMEROS NEUROTÓXICOS!! • Inhibición de la polimerización: oxígeno (bloqueo de R• iniciados por persulfato), pH ácido retarda la polimerización (presencia de ácido acrílico por hidrólisis) • Luz y oxígeno: requeridos cuando se usa riboflavina • Ajuste de la velocidad de polimerización (tiempo): cantidades óptimas de persulfato y TEMED • Temperatura: óptima 25-30°C (a < 10°C: gel inhomogéneo, a 50°C: polímeros cortos)

  7. PAGE: POROSIDAD DEL GELT % y C % • T = (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/v) • C = Bisacrilamida / (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/p) T y C influyen sobre el grado de reticulación (tamaño de poro), resistencia mecánica, fragilidad y elasticidad del gel • T < 4%: geles casi fluidos (agregar agarosa 0,5%) • T > 25% ó C > 10%: geles opacos y quebradizos T (C 1%) Poro kDa 3 - 5 % 70 nm > 150 7 - 10 % 10 nm 40-100 15 - 20 % 5 nm < 10

  8. Polimerización de los monómeros activada por la luz TEMED: sensible a la acción de la luz Evitar presencia de ácido acrílico (hidrólisis de acrilamida) Persulfato de amonio: hidratación del sólido e inestabilidad de las soluciones Conservar las soluciones en botellas oscuras a resguardo de la luz Agregar a la solución stock resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA-400, Dowex1 ó 2) Preparar soluciones frescas. Conservar el persulfato sólido en desecador y las soluciones a -20°C Consideraciones prácticas

  9. ELECTROFORESISEfecto de la carga eléctrica y el tamaño molecular

  10. GELES DE POLIACRILAMIDA VENTAJAS • Tamiz molecular: tamaño de poro variable • Químicamente inerte frente a moléculas biológicas • Transparente, facilidad para ser densitometrado • Estable en amplio intervalo de pH, fuerza iónica y temperatura • Resistente a agentes desnaturalizante • Fuerza electroendosmótica reducida • Mecánicamente estable • Fácil de almacenar • Amplia versatilidad para la detección de compuestos analizados DESVENTAJAS • Toxicidad de los monómeros • El material no puede ser recuperado

  11. PAGE • CILINDRO (ROD) - PAGE VERTICAL Tamaño variable. Siembra única. Dificultad para estandarizar. PAGE preparativa. Facilidad para PAGE en sistema multifásico de buffers. Equipo especial. • PLACA (SLAB) - PAGE HORIZONTAL Espesor variable. Siembra múltiple y en distintas zonas del gel. Equipo común para otros sistemas electroforéticos. • PLACA (SLAB) - PAGE VERTICAL Espesor variable. Siembra múltiple. Sentido único de electroforesis. Facilidad para PAGE en sistema multifásico de buffers. Equipo especial. Ventaja en estandarización del proceso.

  12. PAGE • SISTEMA HOMOGENEO DE GEL Y pH • SISTEMA DE GEL DISCONTINUO Caso especial: gel con gradiente de poro • SISTEMA MULTIFÁSICO DE BUFFERS (concentración de la muestra) • CONDICIONES NATIVAS • CONDICIONES DESNATURALIZANTES (ruptura de agregados, disociación en subunidades, solubilización). Posible alteración de actividad biológica, enzimática, inmunológica. • Urea 6-8 M (agregada a muestra y gel): ruptura de puentes de H • Detergentes no iónicos (Tritón X-100, Tween 20) o glicerol (70%) • 2-mercaptoetanol o DTT (reducción de -S-S-): agregados a la muestra. No agregar al gel: inhibición de polimerización. • Detergentes (aniónico SDS, catiónicos BCTA o CPC)

  13. DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES.I.-DIAGRAMA DE FERGUSON • log m = log m0 - KRT • log Rf = log Y0 - KRT 1) PAGE de proteína X y 7 proteínas estándar en 5 geles con diferentes T% 2) Para cada proteína: gráfico de log Rf vs. %T 3) Para cada proteína, cálculo de KR (pendiente de la curva) 4) Gráfico de Mr (estándar) vs. KR 5) Mr de proteína X por interpolación del KR

  14. PAGE - GRADIENTE DE PORO

  15. DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES.II.-PAGE EN GRADIENTE DE PORO • Gradiente adecuado a los componentes de la muestra: 4-16, 4-24, 4-30 • Sistema multifásico de buffers • Inclusión de marcadores de tamaño molecular (características similares a las de las proteínas en estudio) • Curva de calibración: tamaño molecular vs. D recorrida o T alcanzada

  16. DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES. III.- SDS-PAGE • Combinación de la proteínas con SDS para enmascarar las cargas (tratamiento de la muestra) • Agregado de SDS a la muestra y al buffer de los compartimientos electródicos • Elección del T% del gel de separación de acuerdo con el tamaño de los compuestos a analizar • Inclusión de marcadores de tamaño molecular (características similares a las de las proteínas en estudio) • Electroforesis • Curva de calibración: tamaño molecular vs. distancia recorrida

  17. SDS- PAGE: curva de calibración y determinación de tamaños moleculares

  18. SDS-PAGEEFECTO DE AGENTES DESNATURALIZANTES

  19. GELES DE POLIACRILAMIDA APLICACIONES • DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES • ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD MOLECULAR (VARIANTES GENÉTICAS) • INTERACCIONES (AGREGACIÓN, DISOCIACIÓN) • INTERACCIONES (LIGANDO-RECEPTOR) • IDENTIFICACIÓN (REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO) • ESTRUCTURA (PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS, PUENTES DISULFUROS) • MODIFICACIONES POTTRDUCCIONALES (GLICOSILACIÓN, FOSFORILACIÓN) • ISOENZIMAS

  20. Rango de separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida

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