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FERMENTACIÓN INDUSTRIAL.

FERMENTACIÓN INDUSTRIAL. Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa.

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FERMENTACIÓN INDUSTRIAL.

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  1. FERMENTACIÓN INDUSTRIAL.

  2. Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa. La fermentación es un proceso de oxidación incompleto, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. Fermentación Aerobia: OXÍGENO Fermentación Anaerobia: NITRÓGENO

  3. UPSTREAM Medios: • M. Sintéticos: quimicamente definidos. • M. Complejos: Origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, extracto de soja. Quimicamente indefinidos y de composición variable. Componentes: • Macronutrientes: Fuentes de C, N, S, P, K y Mg, en g/l. • Micronutrientes: Elementos traza. Sales de Fe, Mn, Ca, Zn, Co, en mg/l. • Factores de Crecimiento:vitaminas, aminoácidos, acidos grasos, etc.

  4. Medio de Cultivo: Conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Diversidad metabólica Diversidad de medios Esterilizacion: autoclave o filtración (termolábiles)

  5. Constituyentes: - Agar: Ag solidificante. Polisacárido de algas marinas. Las bacterias no lo degradan. • Azúcares: Fuente de C, glucosa, lactosa, sacarosa. • Extractos: Preparados de órganos o tejidos animales o vegetales, extracto de carne, levadura. Preparados con agua y calor • Peptonas:Proteínas hidrolizadas, obtenidas por digestion química o enzimáticas de proteinas animalers o vegetales. • Fluidos: Sangre, plasma o suero. Se añaden a otros medios. • Amortiguadores: Sales para mentener el pH en rangos òptimos. Fosfátos de Na y K. • Indicadores de pH: Indicadores acido-base añadidos para detectar el cambiuo de pH. • Agentes Reductores: Sustancias para crear condiciones apropiadas. Cisteína, tioglicolato. • Agentes Selectivos: A determinadas concentraciones seleccionan microorganismos. Cristal violeta, sales biliares.

  6. Tipos de medios de cultivo. Por su consistencia: • Sólidos: Contienen agente gelificante (agar). Petri o Slant • Líquidos: Caldos. Se preparan en tubos y matraces. Por su composición: • Medios Generales: Desarrollo de gran variedad de MO. • Medios de Enriquecimiento: Favorecen el desarrollo de determinado grupo de MO. • Medios Selectivos: Crecimiento de un tipo de MO e inhiben el desarrollo de los demás. • Medios Diferenciales: Énfasis en alguna propiedad que un determinado MO posee.

  7. Diseño del Medio Elegir los componentes necesarios para lograr el crecimiento y formación de productos en el proceso. Conocer los proceso y operaciones previos y conocer los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de productos. Requerimientos Nutricionales: Tipo de metabolismo celular: Autótrofos: Algas, bacterias que obtienen C del CO2 Heterótrofos: Requieren compuestos orgánicos como fuente de C. Condiciones de Cultivo: Aerobio: oxigeno como aceptor de electrones Anaerobio: N, SO4, NO3 como aceptor de electrones.

  8. Fuentes de nitrógeno: Inorgánica u Orgánica, síntesis de proteínas, ácidos nucleicos, pared celular Macronutrientes: P y S en forma de PO4 y SO4, para formar ADN, ARN, , aminoácidos azufrados. K y Mg, ligados al RNA. K actúa como coenzima y Mg es estabilizador de organelos y es cofactor. Micronutrientes: - Esenciales: Ca, Mn, Fe, Cop, Cu, Zn. - Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo Difíciles de cuantificar y sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a “stress”. Factores de crecimiento: Aminoácidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayoría son constituyentes de coenzimas

  9. Disponibilidad de los Componentes: Componentes susceptibles de ser usados por la célula. Concentración de iones metálicos modificada por quelación, para controlar el fenómenos se usa agentes quelantes, EDTA. Se debe tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgánicos que pueden actuar como ligandos y sobre todo del ion metálico considerado, es necesario controlar su concentración. Materias Primas: Se debe considerar costos, disponibilidad y estabilidad en su composición química. Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y N.

  10. Formulación. Se refiere a los aspectos cuantitativos de los medios. Tener una aproximación a la composición de la biomasa del microorganismo. Una composición elemental en peso seco es: • Carbono: 46 – 48% • Nitrógeno: 7-12 • Fósforo: 1 – 3 • Azufre: 0.5 – 1 • Mg: 0.5 – 1

  11. Composición de medio mínimo para Klebsiella aerogens

  12. CINETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO 5 6 4 Log X 3 2 1 T

  13. Microbiología Industrial Parte de la Microbiología que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos. También son los procesos industriales catalíticos basados en el uso de microorganismos.

  14. Generalidades de la Fermentación. Fermentación: Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa. Microorganismo Aumenta concentración. Medio Se va modificando Resultado…..Formación de de nuevos productos como consecuencia del metabolismo.

  15. Influencia de los Efectores Comportamiento de microorganismo es el resultado de la interacción entre el MO y el medio ambiente por los efectores: internos y externos. Efectores Internos --------- Dotación genética Efectores Externos -------- Expresión fenotípica

  16. METABOLITOS PRIMARIOS:moléculas de bajo peso molecular que intervienen, como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas metabólicas. Los más importantes desde el punto de vista industrial son los aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos y alcoholes. METABOLITOS SECUNDARIOS:moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento. antibióticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (ácido lisérgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.

  17. Efectores Internos (Dotación genética) Efectores Químicos (nutrientes) Expresión Producto (metabolitos) Efectores Físicos (temperatura, agitación, viscosidad, etc.)

  18. Selección, Mantenimiento y Mejoramiento de MO. SELECCIÓN: • Cepa genéticamente estable. • Velocidad de crecimiento alta. • Cepa libre de contaminantes • Requerimientos nutricionales bajos. • Fácil conservación por periodos largos de tiempo • Fermentación completa en corto tiempo. • Alto rendimiento de producto y de fácil extracción

  19. AISLAMIENTO: • A. Directo: El medio debe permitir una expresión máxima del material genético. Por ejm. Aislamiento en función de halos de inhibición • Enriquecimiento del cultivo: Consiste en incrementar en una población mixta el número de organismos de interés. Realizar subcultivos y evaluar la velocidad específica de crecimiento (µ) µ S

  20. Porque y para que conservar los cultivos? • El cultivo (cepa microbiana o viral, línea celular, etc), es el elemento vital de la investigación o producción industrial • Conservar implica mantener la viabilidad y propiedades genéticas del cultivo durante un determinado período de tiempo • Consecuencias de una adecuada conservación: estabilidad de las cepas de producción, pureza, reproductibilidad de la investigación. Reposición

  21. Conservación de cultivos • Espacio físico e infraestrutura • Personal capacitado • Recursos económicos Inversión Potencial limitación de los métodos para conservar Daño económico Pérdida del cultivo

  22. Potenciales ventajas del depósito de material biológico • Patente • Conveniencia logística del almacenamiento centralizado • Seguridad de abastecimiento del material ante pérdidas eventuales • Adecuada información de los riesgos ambientales y para la salud • Seguridad en la conservación

  23. Esquema del proceso de conservación y sus etapas críticas Aislamiento primario Microorganismo viable (genética/fenotípo) 3 Reactivación cultivo 1 Almacenamiento Tipo de propágulo Estado fisiológico 2 Proceso de conservación

  24. Métodos de conservación de cultivos 1. con crecimiento transferencia seriada 2. con metabolismo limitado agua destilada bajo aceite mineral (control por O2) 3. con metabolismo detenido 3.1 Congelamiento (crioconservación) 3.2 Deshidratación L-drying: secado desde la fase líquida, silicagel, celulosa (papel),suelo,perlas de porcelana Liofilización (freeze-drying)

  25. CRIOCONSERVACIÓN • Crioconservación es la conservación de material biológico a muy bajas temperaturas • Rango -20 ºC a -196 ºC (nitrógeno líquido) • El nitrógeno líquido es la temperatura práctica mas baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusión molecular es extremadamente lenta y la probablilidad de que ocurran reacciones químicas es prácticamente nula

  26. CRIOINJURIA • El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en las céluas que pueden resultar letales • Los procesos perjudiciales son: formación de cristales de hielo, exosmósis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratación, aumento de la concentración de osmolitos, disminución del pH, alteraciones de la actividad enzimática, acumulación de metabolitos, incremento del contacto entre moléculas, ruptura de puentes de H, distorsión de macromoléculas, solidificación, pérdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones, etc • La formación de hielo intra o extracelular es quizás el evento mas crítico de la crioinjuria.

  27. Congelamiento lento (efecto soluto) exosmósis Hielo extracelular shrinkage (efecto soluto) Congelamiento rápido ( efecto hielo ) Daño mecánico Hielo intracelular INJURIA POR CONGELAMIENTO

  28. CRIOPROTECCIÓN • Control de la velocidad de enfriamiento Balance óptimo entre el efecto soluto y la formación e hielo. En la práctica es aceptable 10 ºC/min. El descongelamiento debe ser lo mas rápido posible • Incorporación de crioprotectores (CPs) CPs que permean la pared y membrana celular Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol Cps que permean la pared pero no la membrana mono y disacáridos, aminoácidos, polímeros de bajo PM(PEG 600-1000) Cps no permeantes Polímeros de alto PM: proteínas, polisacáridos, PVP

  29. El tipo de protección que ejerce el CPs depende de su permeabilidad • Todos los CPs son altamente hidrofílicos • CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y reducen el efecto soluto • CPs semipermeables forman entre la pared y la membrana celular una capa que proteje la célula del daño mecánico • CPs no permeables se adsorben en la superficie celular incrementando la viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma amorfa evitando daño mecánico

  30. Empleo de CPs en criopreservación • Frecuencia de uso de CPs Virus: Me2SO, Suero sanguíneo, Sacarosa Glicerol Bacterias: Me2SO, Suero sanguíneo, Sacarosa, Glicerol, leche descremada Hongos: Me2SO, Glicerol Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP Protozoarios: Me2SO, Suero sanguíneo, Glicerol, Sangre desfibrinada • Rango de concentraciones de CPs Me2SO: 1-32 % (media 10 %) Glicerol: 5-50 % Sacarosa: 1-68 % (media 10 %) Metanol: 2-10 % (media 5 %) • Tiempos de contacto CPs-célula: Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10ºC

  31. CONSERVACIÓN POR DESHIDRATACIÓN • Este método implica la remoción de agua de las células (humedad final típica: 0.06-5.0 % de agua). • La deshidratación puede llevarse a cabo desde la fase líquida (L-drying)o por sublimación desde el estado congelado (liofilización) • Las pérdida de viabilidad durante la deshidratación es principalmente atribuida a alteraciones de la membrana celular. • Las células deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxígeno • El deterioro de las células durante la deshidratación puede ser controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los componentes tóxicos que la célula puede liberar durante el secado. Otro protectores interactúan con las membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro • Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminoácidos (glutamato) y azúcares (sacarosa, trealosa)

  32. Principios de la liofilización muestra + protectores en ampollas vacío 30-60 militorrs manifold -70 ºC  - 5 ºC Bomba de vacío de aceite trampa de agua congelamiento etilenglicol + hielo seco (- 40 ºC) etanol + hielo seco (-70 ºC) La muestra colocada en una ampolla estéril con un plug de algodón, se congela entre - 40 ºC y -70 ºC. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el vacío y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 ºC. A esta temperatura y con un vacío entre 30 y 60 militorrs, el secado es rápido. El tiempo es variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vacío

  33. L-Drying Impregnación en soporte Muestra Secado sobre silicagel perlas de porcelana, papel de filtro, suelo • Preservación en suelo (sand loam) para microorganismos filamentosos • Secar suelo 6 hs a 150 ºC • Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados • Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20 mm y tapar con plug de algodón recubierto de gasa • Autoclavar 60 min 3 días consecutivos y secar • Incorporar 1 ml de suspensión de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo) • Secar a temp ambiente (24 ºC) un mes • Conservar en frío

  34. Consideraciones para la preservación de cultivos • Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados. • Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, líquido, sólido), el estado fisiológico de las células al momento de la cosecha (cultivos líquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logarítmica), si se emplean células con medio ó lavadas. Determinar si el agente protector es tóxico. • Definir condiciones de proceso: concentración de células, tiempo de secado, agregado de protectores • En procesos industriales la viabilidad no es lo único importante. La cepa debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de producción o bioensayo • Durante la recuperación de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfología, formación de producto, rasgos recombinates (plásmidos, resistencia a antibióticos, etc).

  35. Comparación de algunos métodos de preservación

  36. BIBLIOGRAFIA: • Texto Base: • CRUEGER, Wulf. CRUEGER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia. Tercera Edición. Zaragoza, 2000. • Textos Complementarios: • PRESCOTT, Lansign. HARLEY,John. KLEIN, Donald. Microbiología. McGraw-Hill. Cuarta Edición.Madrid, 1999. • RHODES,Alan. FLETCHER, Derek. Principios de Microbiología Industrial. Editorial Acribia. Zaragoza 1994. • SCRAGG, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Editorial Limusa. Primera Edición. México, 1997. • www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI Data Base) • www.ejbiotechnology.info (Electronic Journal of Biotechnology)

  37. Que es…. Parte de la Microbiología que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos (bienes y/o servicios). Son aquellos procesos industriales catalíticos basados en el uso de microorganismos. Microbiología industrial Biotecnología Industrial

  38. Libro del Génesis (9: 20,21): “Noé se dedicó a la labranza y plantó una viña. Bebió del vino, se embriagó…” 6000 a.C.: Los sumerios y babilonios usaban levaduras para fabricar cerveza. 4000 a.C.: Los egipcios descubrieron la manera de fermentar pan con levadura.

  39. Siglo XIV : Destilación de bebidas alcohólicas. Uso de bacterias de ácido acético para fabricar vinagre, de bacterias de ácido láctico para conservar la leche (yoghurt, kefir). Siglo XVII: Anthony von Leeuwenhoek (1632-1723) descubre el mundo microbiano con sus microscopios primitivos. Siglo XIX: El desarrollo técnico de los microscopios permite demostrar el origen de los microbios y vencer la creencia de la “generación espontánea”.

  40. Observaciones y recetas sobre la “generación espontánea”... Ambroise Paré (1517-1590), el más célebre cirujano de su siglo, escribe:“Hallándome en una viña de mi propiedad, próxima al pueblo de Meudon, hice romper una enorme cantidad de grandes piedras sólidas. Dentro de una de ellas se encontró un grueso sapo vivo, sin que hubiera en la piedra la menor apariencia de abertura…

  41. …Me maravilló el hecho de que este animal hubiese podido nacer, crecer y vivir allí. Pero el cantero me dijo que no había por qué asombrarse, pues varias veces había hallado animales de ésta y de otras clases en lo más recóndito de las piedras, sin que existiese el menor indicio de una abertura. Se puede explicar así el nacimiento y la vida de estos animales: son engendrados a partir de alguna sustancia húmeda de las piedras, cuya humedad, al entrar en putrefacción, produce tales seres.”

  42. Van Helmont (1577-1644), el más grande fisiólogo de la época, sugiere lo siguientes para obtener ratones: un vaso lleno de trigo se cubre con una camisa sucia, preferentemente de mujer. “Un fermento originado en la camisa y transformado por el olor de los granos, convierte el trigo mismo en ratones.” Esta metamorfosis dura cerca de veintiún días, o sea el tiempo de gestación de ratón y nuestro naturalista se asombre de su notable rapidez…

  43. …”Ello, nos dice, es tanto más admirable cuanto que los ratones originados por el trigo y la camisa no son pequeños ni lactantes, ni minúsculos, ni deformes, sino muy bien formados y pueden saltar.” Francesco Redi (1626-1697): Médico italiano demostró que los gusanos de la carne son larvas de mosca y que no aparecen si la carne se guarda bien tapada. Lázaro Spallanzani (1729-1799): Naturalista italiano, demostró que los microbios son transportados por el aire; los mismos no invaden los frascos cerrados herméticamente. Nicolas-Francois Appert (1750-1841): Desarrolla los primeros procedimientos de enlatado.

  44. Louis Pasteur (1822-1895): Sentó las bases de la futura industria biotecnológica al demostrar que todos los procesos de fermentación eran el resultado de la actividad microbiana. Edward Buchner (1860-1917): Descubre, dentro de las células microbianas, las sustancias vitales responsables de todas las transformaciones químicas: las enzimas. Hasta la primera guerra mundial, apenas progresó la idea de utilizar bacterias y levaduras para fabricar otra cosa que no fuera alcohol. Sin embargo, las restricciones impuestas durante el conflicto anunciaron lo que puede llamarse como “segunda era biotecnológica.”

  45. Hasta la primera guerra mundial, apenas progresó la idea de utilizar bacterias y levaduras para fabricar otra cosa que no fuera alcohol. Sin embargo, las restricciones impuestas durante el conflicto anunciaron lo que puede llamarse como “segunda era biotecnológica.”

  46. La Guerra Mundial (1914-1918) supuso demandas biotecnológicas: • Proceso Neuberg para producir glicerol (para nitroglicerina) mediante la “fermentación dirigida” de Saccharomyces cerevisiae. Agregando álcali y bisulfito de sodio al depósito de fermentación alcohólica se fomentaba la producción de glicerol. • Proceso Weizmann, usando Clostridium acetobutylicum, para la producción de disolventes como la acetona (fabricación de cordita).

  47. Los descubrimientos de Pasteur, Robert Koch (1843-1910) y Alexander Fleming (1928) revolucionaron el tratamiento de las enfermedades infecciosas con el descubrimiento de los antibióticos. Durante la Segunda Guerra Mundial comienza la tercera era biotecnológica, por la necesidad de contar con ciertos medicamentos para que las víctimas no murieran de sepsis bacteriana.

  48. “Cuarta era biotecnológica” comienza a principios de la década de 1970, con el advenimiento de la Ingeniería Genética. El descubrimiento de los sistemas de restricción y modificación en bacterias y la aplicación de las endonucleasas. Los trabajos de Milstein y Kohler sobre la formación de hibridomas con la posterior utilización para la producción de anticuerpos monoclonales (1975).

  49. Un hito ocurrió en 1982 cuando la compañía Eli Lilly consiguió la aprobación de la (F.D.A) Food and Drug Administration de los Estados Unidos de Norteamérica para la utilización de “insulina humana” clonada y producida en Escherichia coli. A esto siguieron los interferones, hormonas de crecimiento humana y bovina, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, etc.

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