MISURE BIOELETTRICHE

1. MISURE BIOELETTRICHE Misura del potenziale di membrana e del trasporto ionico attraverso epitelio isolato di rana

2. GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA Il potenziale di membrana è una differenza di potenziale(d.d.p.) elettrico che si misura ai due lati di una membrana plasmatica. Questa d.d.p. è stabile nel tempo (tranne nelle cellule eccitabili), dura per tutta la vita cellulare ed è fondamentale per tutti i fenomeni cellulari. DE = - 80 - -90 mV (lato int. negativo, lato est. positivo)

3. La genesi di questa d.d.p. è legata all’esistenza di un disequilibrio ionico tra ambiente intra ed extracellulare.

5. Per spiegare il potenziale di membrana dobbiamo considerare due questioni: (1) La prima è la facilità con la quale le particelle cariche (Na+, K+ ecc.) possono muoversi attraverso la membrana. Questa facilità è influenzata dal numero e dal tipo di canali ionici presenti nella membrana, che determinano la permeabilità della membrana agli ioni. (2) La seconda è la concentrazione degli ioni all’interno e all’esterno della cellula (fluido intra ed extracellulare).

6. Il potenziale di membrana è un potenziale di diffusione, poiché gli ioni hanno diversa mobilità (cofficiente di permeabilità del Na+ << K+). LEGGE DI HODGKIN-KATZ RT ln Pk[K+]e + PNa [Na+]e DE = F Pk[K+]i + PNa [Na+]i Se i due coefficienti di permeabilità (P) fossero uguali non avremmo polarizzazione della membrana: la tendenza del K+ ad uscire dalla cellula più velocemente del Na+, polarizza negativamente la membrana , attrae il Na+ e favorisce il suo ingresso.

7. int est - + 3Na+ ATP-ase 2K+ Come mai il potenziale di membrana non va a zero? K+ Na+

8. EPITELIO PLURISTRATIFICATO AD ALTA RESISTENZA ELETTRICA • La pelle di rana è oggi considerata un modello ideale per lo studio dei fenomeni bioelettrici e di trasporto epiteliale. • Vantaggi: • facilmente isolabile • sopravvive per molte ore in vitro sotto ossigenazione con aria atmosferica a t.a. • può essere usata come membrana di separazione tra due soluzioni sperimentalmente manipolabili con semplicità.

9. ambiente esterno all’organismo membrana apicale giunzione intercellulare membrana basolaterale ambiente interno dell’organismo membrana epiteliale: membrane plasmatiche in serie ambiente esterno ambiente esterno membrana plasmatica ambiente interno ambiente interno CELLULA PROCARIOTE: membrana plasmatica CELLULA EUCARIOTE: membrana plasmatica emembrane intracellulari

10. VIA INTRACELLULARE VIA INTERCELLULARE LE VIE DI PERMEAZIONE TRANSEPITELIALI

11. R intercellulare 10-100 volte < R cellulare R intercellulare = o > R cellulare Trasportano soluz. isotoniche a elevata velocità senza sviluppare gradienti osmotici. Trasportano soluz. ipertoniche a bassa velocità o isotoniche a maggiore velocità

12. strato corneo pluristrato La pelle di rana è un tessuto molto umido, viscido per la presenza di un sistema ipersecretorio di muco e di altre sostanze.

14. RANE VELENOSE: Fam. Dendrobatidi, gen. Phyllobates Poiché la cute di questi animali rappresenta un perfetto substrato per la crescita dei microrganismi patogeni (batteri e funghi), le ghiandole cutanee hanno sviluppato la capacità di secernere tossine che agiscono da antibiotici proteggendoli dalle infezioni. Questi veleni (alcaloidi) venivano utilizzati dai cacciatori indios per avvelenare le frecce.

15. BATRACOTOSSINE Sono le più potenti tra le tossine non proteiche di origina naturale. Fanno aumentare selettivamente la permeabilità della membrana esterna delle cellule nervose e muscolari agli ioni sodio: depolarizzazione elettrica irreversibile (aritmie cardiache, fibrillazione, collasso). Il legame della tossina ai canali del Na+ ne impedisce la normale chiusura : le cellule nervose non riescono più a trasmettere impulsi e quelle muscolari restano in uno stato attivo, contratto.

17. EPITELIO DI RANA organo osmoregolatore Negli anfibi l’acqua rappresenta circa il 75% del peso totale del corpo. Sulla terraferma con l’evaporazione perdono acqua attraverso la pelle e tornano in acqua per non disidratarsi .

18. sali TRASPORTO ATTIVO di Na+ H2O reni di mammifero H2O ambiente est (stagno) ambiente int (sangue) IPEROSMOTICO

19. Frog skin -- a functional analog of thedistal tubule • Many functions • Epithelial tissue • Uptake of NaCl across the body surfaceagainst a great gradient of electrochemicalpotential • The mechanism of Na + transport is similar tothat of the distal tubule

20. FUNCTIONS OF THE KIDNEYS • Regulation of body fluid osmolarity and volume • Regulation of electrolyte balance • Regulation of acid-base balance • Excretion of metabolic products and foreignsubstances • Production and secretion of hormones • Gluconeogenesis

21. Excretion • Metabolic end products: – Urea (from amino acids) – Uric Acid (from nucleic acids) – Creatinine (from muscle creatine) • Foreign substances

22. Struttura del rene

23. Basic renal processes 1. Glomerular filtration all low MW substances are filtrated GFR ~180L/day 2. Tubular secretion H + , K + , foreign chemicals 3. Tubular reabsorption Final urine ~1.5L/day, >99%reabsorbed

25. Distal Tubule andCollecting Duct • Most important in the finalregulation of salt and waterbalance • Reabsorb only 12% of theglomerular filtrate • The sites where the hormones andother factors affect

26. Study of transepithelial transport • Asymmetry of the epithelialtissue • Apical surface: faces the non-bloodsupply surface • Basolateral surface: faces theblood supply surface • Vectorial transport

27. K+ Na+ - 2K+ ATP-ase + ATP ADP + Pi 3Na+ est membrana apicale ddp=50-100 mV membrana basolaterale int

28. Short-Circuit Method of Ussingand Zerahn (1950) • Si bagna l’epitelio simmetricamente con una soluzione Ringer per eliminare il gradiente di concentrazione. • Si esegue un Voltage-clamp del tessuto per azzerare il gradiente elettrico dell’epitelio. • Si misura la corrente di corto circuito, che è generata soltanto dal trasporto ionico attivo.

29. USSING studiò il modo di calcolare, a partire dalla d.d.p., la quantità di Na+ trasportato attraverso l’epitelio. La corrente non può essere misurata direttamente con un amperometro, in quanto presenta una resistenza interna > di quella del tessuto. Si ricorre al metodo della CORTOCIRCUITAZIONE: consiste nel far passare attraverso il tessuto una corrente elettrica opposta (CORRENTE DI CORTO CIRCUITO, CCC) in grado di azzerare il potenziale elettrico misurato col voltmetro. La CCC corrisponde esattamente al trasporto attivo di Na+ transepiteliale.

30. Lab procedures I. Dissect frog skin (ventral skin) II. Prepare salt bridge electrodes III. Connect the chamber/base to the voltage clamp IV. Put the skin between the chambers V. Install salt bridge electrodes VI. Record data

31. CAMERETTE DI USSING e i ELETTRODI A CALOMELANO: non vengono posti direttamente nella soluzioni di incubazione perché contengono KCl 2.7M, circa 500 volte quello della soluzione Ringer e produrrebbero la morte cellulare. Ciascuna boccetta in cui è immerso l’elettrodo viene collegata alla soluzione fisiologica mediante un ponte di agar, ossia un tubicino riempito con soluzione fisiologica intrappolata nel gel.

32. Soluzione Ringer (mM): NaCl 112, KCl 5, CaCl2 1, NaHCO3 2.5, pH 8.1. Soluzione fisiologica con le stesse concentrazioni ioniche del liquido interstiziale, gorgogliata con aria atmosferica, per assicurare l’apporto di O2 e CO2 . Quest’ultimacontribuisce a formare il tampone acido carbonico /bicarbonato che mantiene il pH della soluzione fisiologica stabile al valore 8.1.

33. ELETTRODI DI PLATINO: posti direttamente nelle soluzioni di incubazione di ciascuna emicamera e servono per inviare la CCC. Poiché la d.d.p. è dovuta al trasporto di Na+, l’entità della CCC sarà proporzionale al trasporto di Na+.

34. I parametri elettrici dell’epitelio sono d.d.p. transepitaliale e CCC. Sapendo che: Amper= coulomb/sec 96500 coulomb=1 F (quantità di carica trasportata da 1 mole di ioni) V= R x I (I legge di Ohm) Dai valori misurati si possono calcolare: Rt = d.d.p. (mV) x sup (cm2) =  cm2 CCC (mA) x 10-3 Na = CCC (mA) x 3600 (sec h-1) = mEq cm-2 h-1 96500 (coulomb mole-1) x sup (cm2)

35. Na+ H2O urea AMPc ATP GTP G G AC GDP ADH L’attività di trasporto può essere influenzata essenzialmente in 2 modi: 1. Agendo sui canali del Na+ presenti sulla membrana apicale - ormoni neuroipofisari (ADH, ormone antidiuretico o vasopressina) esaltano il trasporto di Na+ . Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 • Sintetizzato nel nucleo sopraottico dell’ipotalamo • Secrezione regolata da variazioni osmotiche (> osmolalità del plasma) • o riduzione del volume ematico

36. L’attività di trasporto può essere influenzata essenzialmente in 2 modi: 1. Agendo sui canali del Na+ presenti sulla membrana apicale - ormoni neuroipofisari (ADH, ormone antidiuretico) esaltano il trasporto di Na+ . Na+ 2K+ ATP-ase 3Na+ - diuretici (come l’amiloride) sono invece inibitori specifici dei canali del Na+ e ne bloccano il trasporto passivo . 2. Inibendo l’attività della pompa Na/K ATPasi sulla membrana basolaterale - l’ouabaina è un inibitore competitivo del K+ che entra in cellula attraverso la membrana basolaterale e blocca la pompa determinando un accumulo di Na+ in cellula.

37. Na+ AC Na+ Na+ AMPc ATP GTP G G GDP ADH