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2006 届硕士学位论文答辩会

2006 届硕士学位论文答辩会. 抑癌基因 p16 在宫颈鳞状上皮细胞癌中的作用及其机制 Roles and mechanism of tumor suppressor gene p16 in cervical squamous cell carcinoma. 2003级研究生：邓飞 导师：胡新荣 教授 时间：2003.7～2006.5. 1、前言. 1.1研究背景 宫颈癌通常是指宫颈浸润癌（ Invasive cervical carcinoma, ICC）, 是严重危害妇女生命健康的恶性肿瘤。

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2006 届硕士学位论文答辩会

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  1. 2006届硕士学位论文答辩会

  2. 抑癌基因p16在宫颈鳞状上皮细胞癌中的作用及其机制Roles and mechanism of tumor suppressor genep16 in cervical squamous cell carcinoma 2003级研究生：邓飞 导师：胡新荣 教授 时间：2003.7～2006.5

  3. 1、前言 1.1研究背景 宫颈癌通常是指宫颈浸润癌（Invasive cervical carcinoma, ICC）,是严重危害妇女生命健康的恶性肿瘤。 宫颈癌是由宫颈上皮内瘤（Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN）发展而来的，因此CIN的诊断，对宫颈癌的预防和治疗都有十分重要的意义。

  4. 在宫颈癌的预防和治疗中还存在这以下几个问题：在宫颈癌的预防和治疗中还存在这以下几个问题： 1、宫颈涂片检查的精确度和灵敏度有待进一步提高。 2、存在对宫颈癌前病变的过度治疗。 3、对于宫颈癌特别是中晚期宫颈癌的治疗和疗效仍不能令人满意。

  5. p16 p16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。 p16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子构成，编码产物p16蛋白，由148个氨基酸构成，为16kd。

  6. 细胞分裂增殖 细胞合成相关基因 P RB RB P E2F 细胞分化相关基因 E2F INK4A P P p16 cyclinD1 cyclinD1 cyclinD1 CDK4/6 CDK4/6 P CDK4/6

  7. 肿瘤细胞系和实体瘤中存在p16基因的突变失活 • p16蛋白在正常组织的表达明显高于癌组织 • 还有研究表明p16能降低端粒酶的活性，还与细胞的永生化有关 因此p16被认为是抑癌基因

  8. 问题： 1、肿瘤细胞系与实体瘤中p16的突变与缺失存在差异。一些实验表明实体瘤中极少能检测到p16的失活 2、某些肿瘤中存在p16蛋白的高表达 尽管存在争论，但是越来越多的证据显示p16是 一种抑癌基因。定点基因敲除和基因转染将有 助于澄清疑问

  9. p16与宫颈癌 p16蛋白在宫颈癌中存在过表达 1、宫颈癌早期诊断的潜在辅助分子标志 2、作为潜在的CIN进展的分子标志 3、在宫颈癌的基因治疗中也具有良好的应用前景

  10. 存在的问题： 1、有些实验显示p16蛋白在宫颈癌中表达降低。 2、什么原因致使作为抑癌基因的p16在宫颈癌中的表达升高。 3、做为多肿瘤抑制基因的p16，其抑癌作用是普遍存在，还是仅存在于某种或某几种肿瘤中，在宫颈癌中的作用如何。

  11. 1.2 研究目的 1、观察并进一步明确p16蛋白在宫颈浸润癌及其前期病变中的表达状况和趋势，探讨其在宫颈癌早期诊断中的应用价值； 2、研究高表达的p16蛋白在宫颈鳞状上皮细胞癌中所起的作用。并探讨p16蛋白在宫颈鳞状细胞上皮癌中高表达的机制

  12. 2、实验方法 癌前病变 临 床 病 例 标 本 同一组织来源 宫颈癌 切片、HE p16 不同组织来源 癌前病变 IHC 宫颈癌 冰冻切片 IHC p16 细胞涂片

  13. CO-IP、 western p16高表达的宫颈癌标本 新鲜标本 提取组织块 中的蛋白质 p16低表达的宫颈癌标本 p16-CDK4/6 石蜡标本 IHC 对比不同组的 结果，研究p16 表达升高对其 功能的影响。 pRb、bcl-2、p73

  14. IHC 视网膜母细胞瘤 p16、pRb 乳腺癌 IHC p16 癌旁正常组织 显微切割 PCR 石蜡标本 提取DNA HPV检测

  15. 3、实验结果 3.1免疫组化结果 3.1.1 p16蛋白在宫颈石蜡标本中的表达 总例数 p16 阳性例数 阳性率（％） 宫颈炎 19 0 0a 低度CIN 15 6 40b 高度CIN 42 33 78.6c 癌旁CIN 16 13 81.3d ICC 66 61 92.4e a：与b, c, d, e比较，双侧χ2检验，P<0.01； b：与 c, d, e比较，双侧χ2检验，P<0.05； c：与 e比较，双侧χ2检验，P<0.05。 d：与 e比较，双侧χ2检验，P>0.05

  16. PBS空白对照 慢性宫颈炎

  17. LSIL－CINⅠ HSIL－CINⅡ HSIL－CINⅢ ICC

  18. 宫颈上皮病变旁正常组织， 阳性细胞仅位于下部病变区域， 着色定位于胞核和胞浆， 呈棕黄色，癌旁正常鳞状上皮不着色

  19. 20例冰冻切片的宫颈浸润癌中，有18例p16蛋白免疫组化染色阳性，阳性率达90％，10例宫颈慢性炎的冰冻切片标本全为阴性。其染色结果与石蜡切片的染色结果相近。5例宫颈涂片标本，HE染色证实均有核异型细胞。各例p16蛋白免疫细胞化学染色均阳性，占100％的病例。20例冰冻切片的宫颈浸润癌中，有18例p16蛋白免疫组化染色阳性，阳性率达90％，10例宫颈慢性炎的冰冻切片标本全为阴性。其染色结果与石蜡切片的染色结果相近。5例宫颈涂片标本，HE染色证实均有核异型细胞。各例p16蛋白免疫细胞化学染色均阳性，占100％的病例。 宫颈涂片中正常上皮细胞不着色，p16蛋白表达阴性

  20. LSIL HSIL

  21. 3.1.2 pRb、bcl-2、p73在p16蛋白阳性宫颈癌病例中的表达 pRb bcl-2 p73 + － + － + － p16低表达 7 23 15 15 7 23 p16高表达 13 18 26 5 20 11 P值 >0.05 <0.05 <0.05 双侧χ2检验：p16低表达组与高表达组比较

  22. p16蛋白低表达宫颈癌病例，着色定位于胞浆， 呈浅黄色。

  23. pRb bcl-2 p73

  24. 3.1.3 视网膜母细胞瘤中p16蛋白、pRb和乳腺癌及其癌旁正常组织中p16蛋白的表达 5例视网膜母细胞瘤 石蜡标本中 p16蛋白表达都为阴性。

  25. + － 乳腺癌 5 5 癌旁正常组织 2 8 双侧χ2检验：乳腺癌与癌旁正常组织比较，P>0.05，差异无显著性。 乳腺癌 癌旁正常组织

  26. 3.2 CO-IP、Western-blot结果 根据冰冻切片免疫组化染色情况，选择p16蛋白低表达病例（病例号0507401）和p16蛋白高表达病例（病例号0502688） 冰冻切片空白对照 病变与正常组织均不着色

  27. p16蛋白低表达病例 p16蛋白高表达病例 低表达 高表达 p16（CO-IP with anti-CDK4） p16 β-action

  28. 3.3宫颈石蜡切片中高危型HPV感染情况 随机抽取的27例宫颈石蜡标本，包括慢性宫颈炎4例、CIN 7例、ICC 16例，结果显示均有高危型HPV16、18的感染。 400bp 400bp HPV16（576bp） HPV18（360bp）

  29. 4、讨论 4.1 p16蛋白在宫颈癌中的表达趋势及意义 不同组 织来源 微波 石蜡切片 北京中衫 不同的分 析方法 不同标本 不同的抗原 修复方法 不同厂商 的抗体 冰冻切片 高温高压 不同组 织来源 Santacruz 细胞涂片 结果清楚的显示，宫颈浸润癌及其前期病变细胞中 存在p16蛋白的过表达，且p16蛋白的表达有随宫颈癌的发生 发展逐渐增高的趋势。

  30. p16蛋白免疫组化染色阳性不出现在正常 宫颈上皮细胞，仅出现在CIN和ICC中， 且冰冻切片和宫颈涂片的核异型细胞均呈 阳性表达，提示p16蛋白免疫组化染色可 作为一个宫颈癌及其前期病变的辅助病理 诊断标记。

  31. ？高表达的p16蛋白是 否失去了与CDK4的结合功能 4.2 p16在宫颈癌中的作用 细胞分裂增殖 p16 CDK4 pRb-E2F 诱导相关基因 （bcl-2、p73） p16-CDK4 ？p16蛋白与CDK4结合后能否 降低pRb的磷酸化水平 ppRb-E2F 游离的E2F

  32. 本实验结果显示，宫颈癌中高表达的p16蛋白是 有功能的，能与cyclinD竞争性结合CDK4，而且 总结合量增加。但是并不能降低pRb的磷酸化水 平。

  33. 1、宫颈癌中p16蛋白没有发挥作用 对p16宫颈癌细胞中高表达p16不能抑制 pRb磷酸化的可能机制 的探讨 Rb基因异常 导致pRb失活 p16蛋白依赖于有 正常功能的pRb pRb在p16蛋白发挥 功能以前已失活 70％宫颈癌病例 pRb失表达 宫颈癌普遍的 高危型HPV感染 导致了pRb失活 30％病例仍有pRb的表达，说明部分病例可能不存在pRb的失活， 因此上述机制只是p16蛋白无法影响pRb功能的可能原因之一。

  34. cyclinD p16 > 2、宫颈癌中p16蛋白结合CDK4/6以后发挥了功能，但不足以消除cyclinD-CDK4/6过表达所产生的作用。 CDK4 E2F cyclinD-CDK4 CDK4-p16 > > pRb-E2F ppRb-E2F

  35. 两种机制可能同时存在于宫颈癌中，使得宫颈 癌中高表达的p16蛋白，无法完成其抑癌基因的 功能。 也有研究发现，p16功能也与p16蛋白本身 的状态有关。 p16在宫颈癌中的确切作用及其机制，还需要进 一步的探索。

  36. 4.3 宫颈癌中p16蛋白高表达可能机制探讨 多数研究认为，宫颈癌中p16蛋白的异常表达与高危型 HPV的感染导致的pRb的失活有关。 本实验结果显示，p16蛋白低表达组与高表达组在pRb 活性上存在差异，高表达组的游离E2F水平高于低表达 组。 检测随机抽取病例的高危型HPV感染情况显示，HPV感 染在宫颈中具有普遍性。 因此初步证实了HPV-pRb-E2F-p16途径的存在

  37. 问题 1、pRb的失活存在多数肿瘤中，是不是只要有 pRb的缺失或失活，即能诱发p16蛋白的高表达？ 2、高危型HPV感染在宫颈癌中常见，是不是高 危型HPV的感染都能引起p16蛋白的高表达？

  38. 5例与pRb失活有密切关系的视网膜母细胞瘤中p16蛋白、pRb均未有表达5例与pRb失活有密切关系的视网膜母细胞瘤中p16蛋白、pRb均未有表达 高危型HPV阳性慢性宫颈炎病例，也未见p16蛋白的表 达。 说明只有pRb失活，而没有HPV感染。或者，只有HPV 感染，而未导致pRb失活均不能诱导p16蛋白的表达。 只有当 有高危型HPV感染并且导致Rb失活以后，才会出现p16 蛋白的高表达。

  39. 为验证这一结论，实验中我们检测了乳腺癌及其正常癌为验证这一结论，实验中我们检测了乳腺癌及其正常癌 旁组织中p16蛋白的表达情况 因为乳腺癌中既有HPV感染，又存在Rb基因的失活。 虽然结果显示两组之间p16蛋白的阳性率并无差异，但 是从阳性病例的染色情况看，乳腺癌中p16蛋白呈弥漫 性表达，而癌旁正常组织仅只限于部分腺体。而且，由 于检测的样本例数太少，可能检测不出原本存在于两组 之间的差异。因此乳腺癌中是否存在p16蛋白的高表达， 上述推论是否成立还需要进一步实验去证实。

  40. 5、小结 1、p16蛋白在宫颈浸润癌及其前期病变细胞中表达增高，提示p16蛋白的免疫组化染色可作为一个宫颈癌及其前期病变的辅助病理诊断标记； 2、宫颈癌中高表达的p16蛋白能与CDK4结合，且总结合能力增强，但没有降低pRb的磷酸化水平，不能抑制E2F的释放，没有发挥抑癌基因的功能。也不影响Rb蛋白的表达。 3、高危型HPV感染，及其导致的Rb蛋白的失活是宫颈癌中p16蛋白高表达的必要条件。

  41. 仍存在以下问题需要进一步研究： 1、宫颈癌细胞中的p16蛋白未能发挥维持pRb低磷酸化、抑制E2F释放、抑制细胞分裂增殖、抑制宫颈癌发生发展的作用，其原因及其机制是什么。 2、p16蛋白在宫颈癌中过表达的具体机制如何

  42. 致谢 本课题是在导师胡新荣教授的悉心指导下完成的。从论文方向﹑实验设计到论文撰写都倾注了导师大量的心血。感谢导师三年来在学习、工作上所给予的指导和鞭策， 在生活上给予的关怀与帮助。在此，谨向精心指导和培育我的导师表示衷心的感谢！ 感谢教研室唐慰萍教授、陈小毅教授、孙宁教授、姚运红副教授、姜汉国副教授、卢庆林副教授、赵颖海副教授在课题设计、实验进展和论文完成过程中给予的宝贵指导和帮助！ 感谢病理教研室全体老师，是他们的无私帮助和关心才保证了我整个实验的顺利进行。 感谢附属医院病理科黄应桂主任和全体老师在临床医检、病理诊断实践以及标本收集中所给予的帮助和指导！ 特别感谢唐泽立老师及师妹郑晓娟在HPV检测实验过程中所给予的大力支持和帮助。 感谢我的同学在实验、学习和生活方面所给予的关心和帮助。感谢师妹、师弟邓岩在实验过程中的帮助。和他们度过的美好时光永远值得我怀念！ 感谢我的家人，感谢所有曾给予我关心和帮助的老师、同学和朋友！

  43. 敬请各位老师同学多提宝贵意见

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