TRANSLACJA  BIOSYNTEZA BIA Ł KA Translacja przepisanie informacji zawartej w

1. TRANSLACJA  BIOSYNTEZA BIAŁKA • Translacja • przepisanieinformacji zawartej w • mRNA na cząsteczki efektorowe = • powstanie łańcuchów polipeptydowych = • utworzenie pierwszorzędowej struktury • białek • Biosynteza białka • ogół procesów prowadzących do powstania NATYWNEJ struktury białka. • obejmuje: • translację – fałdowanie – potranslacyjne modyfikacje

2. Istotą procesu translacji jest tworzenie wiązań peptydowych pomiędzy kolejnymi konkretnymi aminokwasami zgodnie z informacją zapisaną kodem genetycznym w genie kodującym dany łańcuch polipeptydowy

3. W procesie translacji uczestniczą

4. RYBOSOMY • struktury o średnicy 20 nm, złożone zawsze z 2 • podjednostek: dużej i małej • obie podjednostki zbudowane są z rRNA i białek • występują w każdej komórce (oprócz dojrzałych • erytrocytów) • są miejscem grupującym składniki uczestniczące • w biosyntezie białka • struktury stanowiące środowisko kontrolujące • oddziaływania pomiędzy mRNA i aminoacylo-tRNA • ogromne kompleksy enzymatyczne o złożonej • strukturze prowadzące reakcję tworzenia wiązań • peptydowych w oparciu o matrycę mRNA • współdziałając z cytoplazmatycznymi, • pomocniczymi czynnikami białkowymi umożliwiają • zaistnienie całej gamy aktywności potrzebnych do • wszystkich etapów translacji

5. Struktura małej podjednostki rybosomuThermus thermophilus Science292 str. 883-96, 2001 Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolutionYusupov MM, Yusupova GZ, Baucom A, Lieberman K, Earnest TN, Cate JH, Noller HF; University of California at Santa Cruz

6. Funkcjonowanie rybosomu • rRNA i białka rybosomów tworzą jednąinteraktywnąstrukturę. • rybosom posiadakilka miejsc aktywnych; każde z nich jest utworzone przez poszczególne grupy białek i odcinki rRNA. • te grupy białek i odcinki rRNAzawszefunkcjonują wkontekście całego rybosomu.

7. tRNA • są małe (73-93 nukleotydów; 25 kDa) • wszystkie tRNA mają podobną strukturę i szereg wspólnych cech • stanowią 15% masy komórkowego RNA • 10-25% nukleotydów zmodyfikowanych

8. KOD GENETYCZNY Nagroda Nobla z medycyny i fizjologii, 1968Robert W. Holley, Har Gobind Khorana, Marshall W. Nirenberg „za rozszyfrowanie kodu genetycznego i wyjaśnienie jego funkcji w syntezie białka”

9. AMINOKWASY - KODONY – tRNA Francis Crick – 1966 – hipoteza chwiejności zasad (wobble hypothesis)

10. Kodony dla seryny UCU, UCC, UCA, UCG AGU, AGC Zgodnie z chwiejnością zasad: Muszą istnieć trzy tRNA dla seryny. Potencjalne antykodony tRNA to (5’-3’): Albo: UGA, GGA i GCU Albo: IGA, CGA i GCU

11. Działanie syntetaz aminoacylo-tRNA • Reakcja tworzenia aminoacylo-tRNA spełnia podwójną rolę: • dopasowanie właściwego aminokwasu do właściwego tRNA • zaktywowanie aminokwasu • Reakcja jest dwustopniowa: • I. • PPi + H2O  2 Pi • II. • aminoacylo-AMP + tRNA aminoacylo-tRNA+ AMP aminoacylo-AMP

12. Zapis sumaryczny aminokwas + ATP + tRNA + H2O  aminoacylo-tRNA + AMP +2Pi

13. Syntetazy aminoacylo-tRNA ENZYMY O WYJĄTKOWO WYSOKIEJ SPECYFICZNOŚCI Specyficznie rozpoznają dany aminokwas Specyficznie rozpoznają izoakceptorowe tRNA dla danego aminokwasu Syntetazy aminoacylo-tRNA posiadają „wewnętrzny mechanizm kontroli jakości” – centrum hydrolityczne, które hydrolizuje błędnie utworzone wiązania. SYNTETAZY STANOWIĄ JEDNEN Z ELEMENTÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA WIERNOŚĆ TRANSLACJI

14. mRNA 30 nukleotydów 10 kodonów E P P A mRNA Rybosom – tRNA – mRNA wzajemne wielkości

15. MIEJSCA A, P, E w RYBOSOMIE A - miejsce akceptorowe (aminokwasowe). W miejscu tym wyeksponowany jest kolejny, pusty jeszcze kodon odpowiadający kolejnemu aminokwasowi jaki ma się przyłączyć do łańcucha białka. Miejsce to wiąże wchodzący do rybosomu odpowiedni aa-tRNA. Jest tworzone przez małą i dużą podjednostkę rybosomu. P - miejsce peptydylowe Miejsce, w którym znajduje się peptydylo-tRNA. Jest tworzone przez małą i dużą podjednostkę rybosomu E – od ang. EXIT, wyjście Miejsce, przez które „pusty” tRNA opuszcza rybosom. Znajduje się w obrębie dużej podjednostki.

16. Ogólny schemat przebiegu translacji

17. ETAPY TRANSLACJI INICJACJA obejmuje etapy przed utworzeniem pierwszego wiązania peptydowego. Obejmuje związanie mRNA do rybosomu oraz utworzenie kompleksu inicjującego. Jest to najwolniejszy etap translacji, decydujący o szybkości całej translacji i najsilniej poddany regulacji. ELONGACJA obejmuje reakcje od utworzenia pierwszego aż po ostatnie wiązanie peptydowe. TERMINACJA obejmuje uwolnienie polipeptydu z rybosomu oraz dysocjację rybosomów na podjednostki. Każdy z tych trzech etapów wymaga obecności specyficznych czynników cytoplazmatycznych. Energia na różnych etapach translacji jest dostarczana przez hydrolizęGTP.

18. Białka G pełnią funkcję MOLEKULARNYCHPRZEŁĄCZNIKÓW (MOLECULAR SWITCH – ON / OFF) nie tylko w translacji GAP - GTPaseActivating Protein (białko aktywujące GTPazę) GEF - Guanine nucleotide ExchangeFactor (czynnik wymiany nukleotydów guaninowych) • Alfred G. Gilman & Martin Rodbell, 1994 Nagroda Nobla zmedycyny • „for discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cells” (początki badań – 1980)

19. WSPÓLNE DLA PROKARYOTA • I EUKARYOTA ETAPY INICJACJI TRANSLACJI • mała podjednostka rybosomu wiąże inicjatorowy tRNA - ten, który niesie pierwszy aminokwas łańcucha polipeptydowego • mała podjednostka rybosomu jest rekrutowana do mRNA i umieszczana w miejscu kodonu inicjacji (initiation codon) • przyłącza się duża podjednostka – tworzy się cały RYBOSOM

20. CZYNNIKI INICJUJĄCE • (INITIATION FACTORS, IF) • Są to białkowe czynniki uczestniczące tylko w • inicjacji. • Wiążą siętylko z małą podjednostką rybosomu • i tylko do czasu jej asocjacji z dużą • podjednostką. Wtedy oddysocjowują. • NIE MA ICH W RYBOSOMIE 70S (80S) • Ta aktywność odróżnia IFodstrukturalnych • (integralnych) białek rybosomów. • Prokariotyczne czynniki inicjujące – skrót IF • Eukariotyczne czynniki inicjujące oznaczamy • eIF (eukaryotic initiation factors)

21. PROKARIOTYCZNE CZYNNIKI INICJUJĄCE IF-1 IF-2 IF-3 IF-1 - jego rola jest najsłabiej poznana. Wiąże się do podjednostki 30S tylko jako część kompleksu inicjacyjnego. Zasłania miejsce A rybosomu. IF-2 - wiąże specyficznie inicjatorowy tRNA i kontroluje jego wejście do rybosomu. Do swej aktywności IF-2 musi być związany z GTP. Jest białkiem G. IF-3 - odgrywa podwójną rolę: 1. Utrzymuje pewną pulę podjednostek 30S w stanie wolnym. Uniemożliwia ich reasocjację z 50S. 2. Kontroluje zdolność 30S do związania mRNA. 30S musi związać IF-3, aby utworzyć kompleks inicjacyjny z mRNA.

22. INICJACJA

23. Kolejność zdarzeń (hipoteza) • Mała podjednostka wiąże IF-3 • Rekrutacja mRNA • Wiązanie IF2-fMet-tRNA w miejscu P rybosomu • Związanie IF2-fMet-tRNA do miejsca P rybosomu zmienia konformację w IF2 i stymuluje wymianę GDP  GTP • Obecność GTP w IF2 sprzyja tworzeniu kompletnego rybosomu (70S). Następuje przyłączenie dużej podjednostki rybosomu • Hydroliza GTP przy udziale białek L7/L12 dużej podjednostki rybosomu i uwolnienie czynników inicjujących z rybosomu.

24. Na czym polega aktywująca rola GTP w przypadku IF2? Obecność GTP determinuje taką konformację IF2, która ułatwia przyłączenie dużej podjednostki rybosomu. Hydroliza GTP do GDP powoduje zmianę konformacji i zmniejszenie powinowactwa IF2 do rybosomu Funkcję czynnika GAP dla IF2-GTP pełni białko L7/L12.

25. INICJATOROWY tRNA • Synteza białka zaczyna się odmetioniny - metionina jest pierwszym aminokwasem tworzącego się łańcucha polipeptydowego • Sygnał stanowi inicjatorowy kodonAUG Istnieją dwa typy tRNA mogących wiązać ten aminokwas i ten kodon (AUG): • Uczestniczący w elongacji: • Uczestniczący w inicjacji: • Ta sama syntetaza aminoacylo-tRNA prowadzi obie reakcje (przyłącza resztę metioniny do obu rodzajów tRNA • U bakterii oraz w organellach (chloroplastach, mitochondriach) inicjatorowy tRNA wiąże metioninę, której grupa aminowa zostaje później FORMYLOWANA N-formylo-metionylo-tRNA(fMet-tRNAf).

26. Dlaczego istnieją różne tRNA dla pierwszej metioniny i pozostałych reszt metioniny? fmet-tRNAfnie może przyłączyć się do miejscaArybosomu. met-tRNAmnie może przyłączyć się do miejscaPrybosomu

27. Inicjacja u bakterii wymaga oddziaływania pomiędzy mRNA i rRNA Skąd rybosom „wie”, który kodon AUG jest startowy? E. coli 5’ CCUCCUUA 3’ Salmonella typhimurium 5’ CCUCCUUA 3’ Bordetella holmesii 5’ CCUCCU 3’

28. W obrębie ok.10 nukleotydów powyżej miejsca startu znajduje się heksamer lub przynajmniej jego część: 5'-AGGAGG-3' fragment polipurynowy określany jako sekwencja Shine-Dalgarno

29. U Eukaryota nie ma takiego mechanizmu U Eukaryota rybosom za pośrednictwem białek wiąże się z czapeczką, skanuje 5’UTR i rozpoczyna translację od pierwszego AUG (w >90% przypadków). Rozpoznawanie właściwego kodonu AUG jest wspomagane przez sekwencję sąsiadujących z nim nukleotydów. Optymalna sekwencja to: G C C A(G) C C AUGG Najważniejsze są: puryna o 3 nukleotydy przed AUG i nukleotyd guanylowy tuż za trójką AUG. Wtedy inicjacja translacji jest najwydajniejsza. Ta sekwencja to tzw. sekwencja Kozak (Kozak sequence; Kozak consensus sequence)

30. Etapy inicjacji translacji u Eukaryota • Utworzenie kompleksu preinicjacyjnego 43S • (mała podjednostka rybosomu + niektóre • czynniki inicjacyjne + Met-tRNAi) • Rekrutacja kompleksu 43S do czapeczki • mRNA • Skanowanie 5’UTR i rozpoznanie kodonu • startowego • Przyłączenie dużej podjednostki rybosomu

31. Aktywacja czynnika eIF2 przez wymianę GDP na GTP: Związanie GTP przez eIF2 zwiększa jego powinowactwo do Met-tRNAi, eIF2 wiąże Met-tRNAi. Powstaje kompleks: eIF2GTP Met-tRNAi Ten kompleks wiąże się do 40S w miejscu P. Powstanie kompleksu eIF2-GTP-Met-tRNAi jest konieczne do tego, aby mała podjednostka związała się z mRNA.

32. eIF4E (25 kDa) wiąże się z czapeczką. eIF4E = białko wiążące czapeczkę (mRNA-cap binding protein) eIF4G (154 kDa) - rusztowanie eIF4A (46 kDa) - helikaza Mała podjednostka rybosomu oddziałuje z mRNA za pośrednictwem białek: cap-mRNA  Białko  Białko  40S

33. N-końcowa domena czynnika eIF4G oddziałuje z białkiem wiążącym czapeczkę. C-końcowa domena czynnika eIF4G oddziałuje z czynnikiem eIF3.

34. Skanowanie 5’UTR i rozpoznanie kodonu startowego

35. Po rozpoznaniu kodonu AUG przez antykodon inicjatorowego tRNA następują zmiany konformacyjne w obrębie kilku czynników inicjatorowych prowadzące do przyłączenia dużej podjednostki rybosomu. Te zmiany konformacyjne są związane z funkcjonowaniem białek G.

36. Regulacja szybkości przebiegu translacji • Zachodzi głównie na etapie INICJACJI (jest to korzystne energetycznie). • Regulacja może dotyczyć: • całego procesu inicjacji (wszystkich białek) • pojedynczych, poszczególnych białek • W regulacji uczestniczą: • elementy cis-regulatorowe (znajdujące się w obrębie cząsteczki poddanej regulacji) • elementy trans-regulatorowe (pochodzące spoza cząsteczki podlegającej regulacji) • ELEMENTY CIS(tu wymienione elementy „samodzielne”) • sekwencje i struktury otaczające kodon • inicjatorowy • struktura 5'UTR (skanowanie, • współzawodnictwo między różnymi mRNA o • czynniki inicjatorowe)

37. Szybkość translacji niektórych białek zależy od poziomu żelaza w komórce Ferrytyna – białko komórkowe magazynujące żelazo (4500 Fe / 1 cząsteczkę białka). Gdy w komórce brakuje żelaza, poziom ferrytyny może ulec obniżeniu. Fe-translacja mRNA ferrytyny W 5’ UTR mRNA ferrytyny znaleziono charakterystyczną strukturę/sekwencję nazwanąIRE (Iron Responsive Element)

38. IRE może przyłączać z wysokim powinowactwem IRP- Iron Regulatory Proteins (np. IRP1) IRE – elementy cis-regulatorowe IRP – elementy trans-regulatorowe Kompleksy IRE/IRP stanowią przeszkodę przy skanowaniu 5’UTR przez małą podjednostkę rybosomu. IRP1 to białko żelazo-siarkowe.

39. Mechanizm działania IRP1 Fe  IRP-1 pozostaje związane z żelazem (z centrami żelazo-siarkowymi) i nie oddziałuje z IRE. Zachodzi bez przeszkód translacja mRNA ferrytyny. ferrytyna 

40. ELONGACJA • Rozpoczyna się od wprowadzenia do • rybosomu drugiego aminoacylo-tRNA • Kończy się z chwilą osiągnięcia przez • rybosom kodonu „STOP”. • Istota elongacji polega na tworzeniu wiązań • peptydowych i translokacji rybosomu • względem mRNA. • Przebiega podobnie u Prokaryota i • Eukaryota. • Uczestniczą w niej cytoplazmatyczne • czynniki elongacyjne: • Prokaryota EF-Tu EF-Ts EF- G • EukaryotaeEF-1AeEF-1BeEF-2

41. Porównanie IF2 i EF-Tu

42. EF-Tu jest białkiem G L7/L12 EF-Tu•GTP - aktywny – ma wysokie powinowactwo do aa-tRNA oraz do miejsca A rybosomu EF-Tu •GDP- nieaktywny – ma niskie powinowactwo do aa-tRNA oraz do miejsca A rybosomu

43. FUNKCJONOWANIE EF-Tu i EF-Ts EF-Tu tworzy kompleks EF-TuGTPaa-tRNA i wprowadza aa-tRNA do miejsca A rybosomu. Ten kompleks może oddziaływać tylko z miejscem A takiego rybosomu, którego miejsce P jest zajęte. Oddziaływanie kodon-antykodon powoduje zmianę konformacyjną w obrębie EF-Tu umożliwiającą hydrolizę GTP  GDP. Kompleks EF-TuGDP ma niskie powinowactwo do aa-tRNA i oddysocjowuje. Opuszcza rybosom. EF-Ts pełni funkcjęGEFdla EF-Tu. EF-Ts wypiera GDP z cząsteczki EF-Tu. Tworzy się kompleks EF-TuEF-Ts. EF-Ts jest w tym kompleksie zastępowany przez GTP  odtworzenie aktywnego EF-TuGTP. EF-TuGTP natychmiast wiąże się z kolejnym aa-tRNA i wprowadza go do miejsca Arybosomu.

44. DOŚWIADCZENIA: • Stosując różne inhibitory stwierdzono, że: • GTP związany z EF-Tu musi ulec hydrolizie do GDP, aby EF-Tu mógł odłączyć się od rybosomu • Aby powstało wiązanie peptydowe • EF-Tu musi opuścić rybosom

45. KONTROLA JAKOŚCI • To, że obecność EF-Tu hamuje tworzenie wiązania peptydowego jest NIEZWYKLE WAŻNE stanowi mechanizmdecydujący o bezbłędności translacji.   • Konformacja miejsca A pasuje do każdego • EF-TuGTPaa-tRNA do miejsca A wejść może każdy aa-tRNA. Pozostać powinien tylko taki, którego antykodon pasuje do kodonu. • Jeśli wejdzie nieprawidłowy aa-tRNA to brak lub bardzo słabe oddziaływanie kodon/antykodon powoduje, żenieprawidłowy aa-tRNA oddysocjowuje z miejsca A.  • Musi to nastąpić zanim zostanie utworzone wiązanie peptydowe.   • Podczas translacji nie zachodzi korekta (proof-reading) charakterystyczna dla procesu replikacji  wbudowywanie aminokwasu musi byćod razu prawidłowe.   • Fakt, że obecność EF-Tu uniemożliwia utworzenie wiązania peptydowego daje CZAS na to, aby nieprawidłowy aa-tRNA oddysocjował z miejsca A rybosomu. • Błędnie wprowadzony aminokwas: 1/10 000.

46. UTWORZENIE WIĄZANIAPEPTYDOWEGO • Aktywność odpowiedzialna za tę reakcję została nazwana: aktywnościąpeptydylotransferazy. • Aktywność peptydylotransferazy znajduje się w dużej podjednostce rybosomu, w miejscu gdzie znajdują się blisko siebie końce aa-tRNA i peptydylo-tRNA.  • Zarówno białka tego obszaru rybosomu, jak i rRNA są konieczne dla tej aktywności.  • rRNA tworzy centrum katalityczne peptydylotransferazy. • Utworzenie wiązania peptydowego nie wymaga na tym etapie dostarczenia energii. Energia wykorzystywana do powstania wiązania peptydowego została już wcześniej zmagazynowana w wiązaniu estrowym między resztą karboksylową aminokwasu a resztą hydroksylową końcowego nukleotydu adeninowego tRNA.

47. TRANSLOKACJA • Następuje po utworzeniu wiązania • peptydowego • W wyniku translokacji deacylowany tRNA • przenosi się do miejsca E. • Peptydylo-tRNA przenosi się z miejsca A • do miejsca P. • Miejsce A zostaje wolne dla następnego • aa-tRNA.

49. Jeden z modeli translokacji Tu uczestniczy czynnik EF-G Według tej koncepcji tworzący się peptyd w zasadzie nie opuszcza miejsca P w dużej podjednostce.

50. Rybosomy nie mogą wiązać równocześnie EF-Tu i EF-G, a więc elongacja następuje zgodnie z cyklicznymi zmianami obecności tych czynników w rybosomie.