PCRREAL TIME PCR

1. PCR&REAL TIME PCR Aras.G�r.Ayhan �NL�

3. Ilk kez 1985'de bilim d�nyasina sunuldugundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem arastirmada hem de klinik laboratuarlarda tanida yeni bir �igir a�mistir. ABD'de Cetus sirketin'de �alisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafindan gelistirilmistir. Metod basit�e t�pte n�kleik asitlerin uygun kosullarda �ogaltilmasidir. (Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayi K.Mullis, 1993 yili Nobel Kimya �d�l�ne hak kazanmistir.

4. PCR Reaksiyonu? PCR reaksiyonunda �� temel basamak vardir ve �ogaltilmis �r�n miktari, bu �� adimin tekrarina baglidir. Denat�rasyon (90-95 �C) Primer baglanmasi (50-70 �C) DNA sentezi (70-75 �C) Bu �� adim bir PCR sikl�s�n� olusturur (Genetik Kavramlar S-515)

5. Ilk adimda, �ogaltilacak DNA denat�re edilerek tek zincirli hale getirilir. Bu DNA temiz olmak zorunda degildir ve genomik DNA, kurumus kan gibi adli tip �rnekleri, uzun s�re saklanmis tibbi �rnekler,, tek bir sa� teli, mumya kalintilari, fosil gibi degisik kaynaklardan elde edilebilir

6. Sicaklik 50 ile 70 �C arasinda bir degere d�s�r�l�r ve primerlerin tek zincirli hale getirilmis DNA�ya baglanmasi saglanir. Bu primerler yapay oligan�kleotidlerdir (15-30 n�kleotid uzunlugunda) ve �ogaltilacak DNA kisminin u�larindaki tamamlayici dizilere �zg�l olarak baglanir.

7. DNA polimerazin isiya dayanikli bir sekli reaksiyon karisimina ilave edilir ve DNA sentezi 70 ile 75 �C arasindaki sicaklikta ger�eklesir.

11. PCR da kullanilan malzemeler Kalip DNA Reaction buffer (x 2,5 �l) forward primer (x 0,5 �l) reverse primer (x 0,5 �l) dNTP (x 4 �l) MgCl2 (x 2,5 �l) Taq Polimraz (x 0,25 �l)

12. PCR�in Sinirlari Kisa �r�nlerin elde edilmesi Kontaminasyona a�ik olma Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA Polimerazin, yari �mr� 92.5�'de 130 dk; 95�C'de 40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir. Ortamda Fenol kalintilarinin bulunmasi PCR i inhibe eder.

13. Real Time PCR Son yilllarda PCR reaksiyonlarinda sicaklik d�ng�leri saglamak i�in kullanilan cihazlarin (thermocycler) hassas �l��m aletleriyle birlestirilmesi, real-time PCR olarak adlandirilan yeni bir y�ntemin gelismesine neden olmustur. Real-time PCR�da �r�nlerin analizi reaksiyon sirasinda yapilmaktadir. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarinin mor �tesi isik altinda g�r�nt�lenmesi gibi islemlerin uygulanmasina gerek kalmamaktadir. Real-time PCR �r�nlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye �zg�n olmayan floresan boyalardan ya da diziye �zg�n problardan yararlanilmaktadir.

15. Ger�ek Zamanli PCR( Real Time PCR ) Isima �zelligine sahip molek�ller kullanarak PCR�i olusurken izleme ve miktar belirleme y�ntemidir.

20. KLASIK PCR PCR sonundaki �r�nler (amplikonlar) saptanir; analiz edilir. �REAL TIME PCR� (GER�EK ZAMANLI PCR) ? PCR devam ederken ortaya �ikan �r�nler saptanmaya basladigi anda degerlendirmeye alinir.

22. Primer se�imi ve dizayni Termalcycler programlari Reaksiyon sartlari Zaman alan analiz islemleri Bir testin optimizasyonu Agaroz jel elektroforezi, Blotlama Kontaminasyon riski Klasik PCR�da Problemler

23. Real-time PCR�in avantajlari Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor Reaksiyon boyunca veri toplanarak ayni anda analiz imkani PCR sonrasi �r�nlerin ikincil bir islemi gerekmiyor (y�ksek verimlilik,d�s�k kontaminasyon riski) ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat) 10�� kati bulan genis dinamik aralik Iki kat degisikligi hizla tanimlayabilmekte Spesifik erime egrisi analizleri ile spesifik amplifikasyonlarin tanimlanmasi Duyarliligi, �zg�ll�g� ve tekrarlanabilirligi y�ksek Konvensiyonel PCR�dan daha pahali degil

24. Real-time PCR�in dezavantajlari  teknik donanim, alt yapi, beceri ve tecr�be gerektiriyor Y�ksek ekipman ihtiyaci Ayni ve farkli laboratuvar�lar arasinda sonu�lar arasi fakliliklar Standardizasyon problemi

37. Exponential Faz Linear Faz (y�ksek farklilik) Plateu Faz (End-point) PCR�in TEMEL FAZLARI

39. Exponential Faz PCR �r�n miktari her siklusta tam olarak iki kat artar Reaksiyon spesifik ve tamdir Reaksiyonun Etkinligi %100 d�r Reaksiyonun t�m bilesenleri tazedir.

42. Linear Faz (y�ksek farklilik) Reaksiyonun kompanenetleri t�kenmeye baslar Reaksiyon yavaslar Olusan PCR �r�nleri degrade olmaya baslar

44. Plateu Faz (End-point) Geleneksel PCR larda jel bazli tani Reaksiyon sonlanmakta Yeni PCR �r�n� olusmamakta PCR �r�nleri degrade olmasi artmakta

47. First of all we need to think about the nature of the PCR reaction in order to understand real time quantitation. The amount of DNA theoretically doubles with every cycle of PCR and this is what this shows, after each cycle the amount of DNA is twice what it was before. After one cycle of PCR, the amount of DNA is twice what it was before, so after two cycles one has 2x2 times as much, after 3 cycles - 2x2x2 times as much or 23 times as much, after 4 cycles 2x2x2x2 times as much or 24 times as much. Thus after n cycles there will be 2n times as much DNA. First of all we need to think about the nature of the PCR reaction in order to understand real time quantitation. The amount of DNA theoretically doubles with every cycle of PCR and this is what this shows, after each cycle the amount of DNA is twice what it was before. After one cycle of PCR, the amount of DNA is twice what it was before, so after two cycles one has 2x2 times as much, after 3 cycles - 2x2x2 times as much or 23 times as much, after 4 cycles 2x2x2x2 times as much or 24 times as much. Thus after n cycles there will be 2n times as much DNA.

48. But of course, the reaction can�t go on forever, and it eventually tails off and reaches a plateau phase, as shown by the figures in red. If we plot these figures in the standard fashion (top), we cannot detect the amplification in the earlier cycles because the changes do not show up on this scale. Eventually you see the last few cycles of the linear phase (pink) as they rise above baseline and then the non-linear or plateau phase (red) - in real life this starts somewhat earlier than shown here. If we plot the amount of DNA on a logarithmic scale, we can see the small differences at earlier cycles - in real time PCR we use both types of graph to examine the data. Note that there is a straight line relationship between the amount of DNA and cycle number when you look on a logarithmic scale - because PCR amplification is a logarithmic reaction.But of course, the reaction can�t go on forever, and it eventually tails off and reaches a plateau phase, as shown by the figures in red. If we plot these figures in the standard fashion (top), we cannot detect the amplification in the earlier cycles because the changes do not show up on this scale. Eventually you see the last few cycles of the linear phase (pink) as they rise above baseline and then the non-linear or plateau phase (red) - in real life this starts somewhat earlier than shown here. If we plot the amount of DNA on a logarithmic scale, we can see the small differences at earlier cycles - in real time PCR we use both types of graph to examine the data. Note that there is a straight line relationship between the amount of DNA and cycle number when you look on a logarithmic scale - because PCR amplification is a logarithmic reaction.

49. In the following discussion the results shown will be those obtained in our laboratory using a BioRad Icycler Real-time PCR instrument. However, analysis with other instruments is similar. Here is a real-time PCR trace for a single well on a 96-well plate, cycles are shown along the X-axis, and arbitrary fluorescence units (actually these are fold increase over background fluorescence) are shown on the Y-axis - the results are similar to our theoretical graph (see insert) - except that the transition to the plateau phase is more gradual. This expt - and everything we are going to discuss - was done with SYBR green, which has very low fluorescence in the absence of double stranded DNA and very high fluorescence in the presence of double stranded DNA.In the following discussion the results shown will be those obtained in our laboratory using a BioRad Icycler Real-time PCR instrument. However, analysis with other instruments is similar. Here is a real-time PCR trace for a single well on a 96-well plate, cycles are shown along the X-axis, and arbitrary fluorescence units (actually these are fold increase over background fluorescence) are shown on the Y-axis - the results are similar to our theoretical graph (see insert) - except that the transition to the plateau phase is more gradual. This expt - and everything we are going to discuss - was done with SYBR green, which has very low fluorescence in the absence of double stranded DNA and very high fluorescence in the presence of double stranded DNA.

50. Floresan Prob Sistemleri Hidrolizasyon problar (TaqMan (PE Biosystem), Beacons, Scorpions) Hibridizasyon problar (Light Cycler (Roche) DNA�ya baglanan (binding) boyalar (SYBR Green)

52. LightCycler sisteminin bir uygulamasinda; yalnizca �ift zincirli DNA�ya baglandiklarinda floresans veren boyalar (Cyber green I) kullanilarak, amlifikasyona bagli DNA artisi, ortaya �ikan floresansin miktari ile �l��lmektedir. Primerin baglanmasini takiben ger�eklestirilen uzama asamasinda hedef DNA�nin �ift sarmal hale gelmesiyle DNA�ya baglanan �cyber green� miktari artmakta ve buna bagli olarak yayilan floresans miktarinda artis g�zlenmektedir.

55. SYBR Green (�ift zincirli DNA ya baglanmakta) �ift zincirli DNA ya baglanmakta) �ift zincirli DNA ya baglandiklari s�rece floresan emisyonu olmakta Spesifik olmayan baglanmalar ger�eklesmekte yogun optimizasyona ihtiyaci yok

56. Taqman LightCycler�in diger bir uygulama sekli, hedefe �zg�l problar kullanmaktir. Burada problarla testin �zg�ll�g� artirilmistir. Problardan biri 3� ucundan floresans boya ile isaretli (don�r boya), digeri 5� ucundan alici boya (acceptor dye) ile isaretlenmistir. Problar hedef amplikonlar �zerinde birbirine yakin (1-5 n�kleotit uzaklikta) yere baglanmakta ve isaretli u�lar yan yana gelmektedir. Iki boyanin yan yana gelmesiyle a�iga �ikan enerji ikinci prob �zerindeki alici boyayi etkileyerek floresans olusumuna yol a�maktadir. �Fluoresance resonance energy transfer, (FRET)� olarak adlandirilan bu enerji transferi sonucunda olusan floresans miktari, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diger bir ifade ile PCR siklusu s�resince olusan amplikonlarin miktarina bagli olarak artmaktadir.

57. TaqMan sisteminde 5� ve 3� u�larindan florokrom maddelerle isaretli prob kullanilmaktadir. Prob�un 5� ucunda raport�r florokrom (6-carboxyfluorescein =6-FAM), 3� ucunda ise baskilayici florokrom (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine =TAMRA) bulunmaktadir. Prob, tek sarmal hale getirilen hedef molek�l �zerinde, primerlerin baglanma b�lgesinin arasinda kalan yere baglanir. Prob-hedef molek�l arasindaki hibridizasyon devam ettigi s�rece raport�r florokrom maddenin sinyal olusturmasi, 3� u�taki baskilayici florokrom tarafindan engellenmektedir. Primerlerin hedef n�kleik asite baglanmasini takiben baslatilan primer uzamasi prob�un baglandigi noktaya kadar geldiginde, sentezin devam edebilmesi i�in Taq DNA polimeraz enzimi 5�?3� n�kleaz aktivitesini kullanarak probu 5� u�tan yikmaya baslar. B�ylece raport�r florokrom serbest hale ge�er ve sinyal olusturur (Sekil 5). Her siklusta �retilen amplikon miktarina paralel olarak sinyal siddeti de artmaktadir

58. TaqMan FRET

61. Spesifite

62. Molecular Beacons

63. MB have three main components to the hairpin structure: A. A sequence specific loop B. An homologous stem structure 3. A 5� reporter and a 3� quencher molecule MB have three main components to the hairpin structure: A. A sequence specific loop B. An homologous stem structure 3. A 5� reporter and a 3� quencher molecule

64. Scorpion Figure 1. Scorpion probing mechanism. Step 1: initial denaturation of target and Scorpion stem sequence. Step 2: annealing of Scorpion primer to target. Step 3: extension of Scorpion primer produces double-stranded DNA. Step 4: denaturation of double-stranded DNA produced in step 3. This gives a single-stranded target molecule with the Scorpion primer attached. Step 5: on cooling, the Scorpion probe sequence binds to its target in an intramolecular manner. This is favoured over the intermolecular binding of the complementary target strand. Figure 1. Scorpion probing mechanism. Step 1: initial denaturation of target and Scorpion stem sequence. Step 2: annealing of Scorpion primer to target. Step 3: extension of Scorpion primer produces double-stranded DNA. Step 4: denaturation of double-stranded DNA produced in step 3. This gives a single-stranded target molecule with the Scorpion primer attached. Step 5: on cooling, the Scorpion probe sequence binds to its target in an intramolecular manner. This is favoured over the intermolecular binding of the complementary target strand.

66. Yeni Prob Sistemleri Peptide nucleic acids (PNAs) n�kleikasit anologlari (Tm 15) Minor Groove Binding (MGB) Locked Nucleic acid (LNA) Oligon�klotid riboz anologlari

67. Threshold Cycle threshold cycle veya CT degeri DRn de �nemli artisin oldugu ilk siklusu ifade eder

69. DRn = (Rn+)- (Rn-)(normalize reporter signal) Rn+ Templatide i�eren reaksiyona giren t�m komponentlerin floresan emisyonu Rn- negatif kontrol�n (pasif Boya) ve reaksiyone olmayan �rneklerin floresan emisyonu DRn Rn+ ve Rn- arasindaki fark olup CT Degerinin hesaplanmasinda kullanilan temel g�stergedir

70.

72. Geri (�Revers�) Transkripsiyon PCR RNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR iki asamali olup RNA�dan tamamlayici DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamanlayici DNA(cDNA)�nin da standart PCR yoluyla �ogaltilmasi asamalarini kapsar.RT-PCR tek asamali bir reaksiyonla da ger�eklesebilir. T.thermophilus (Tth) DNA polimerazi gibi bazi polimerazlar mangan varliginda hem RNA hem de DNA kalip ipliklerini kullanabildiginden t�m islem ayni t�pte tek asamada yapilabilmektedir. RT-PCR, mRNA veya viral RNA miktarlarinin belirlenmesi ile RNA d�zeyinde gen anlatiminda olduk�a duyarli bir y�ntemdir.

73. �IN SITU� PCR PCR ile ilgili �alismalarda diger �nemli bir asama, lam �zerine tespit edilen enfekte h�crede bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNA�nin amplifikasyonu ve sonucun �in situ� hibridizasyon ile g�sterilmesidir. Kisaca; lam �zerine doku veya h�creler konduktan sonra, havada kurutulur ve 105�C�de 30 saniye bekletilir. Paraformaldehitli fosfat tamponlu tuzlu su (%2�lik) ile bir saat isleme alinir. 3 x 0.1 M PBS (Phosphate buffer saline) ile bir kere, 1 x 0.1 M PBS ile �� defa yikanir. Proteinaz K enzimi (5 �g/ml) ile 55�C�de iki saat muamele edildikten sonra, 96�C�de iki dakika tutularak Proteinaz K inaktive edilir. Lam su ile yikanir ve havada kurutulur. Sonra lamin �zerine amplifikasyon sol�syonu eklenir ve plastik kapakla kapatilir. Plastik kapagin etrafi oje ile �evrilir. Lam, otomatik termal �cycler� �zerine konulur. Aluminyum kagit ile kapatildiktan sonra amplifikasyon baslatilir. Amplifikasyondan sonra lam absol� etil alkol i�inde 3-5 dakika tutulur. Sonra 92�C�de 30 saniye denat�rasyon saglanir ve 2 x SSC (Sodyum klor�r + Sodyum sitrat)tamponu ile yikanir. Bunu takiben �zg�l problarla �in situ� hibridizasyon yapilarak amplifikasyon sonucu g�zlenir

74. �ALISMA RAPORU G-Aktin yapimi G-aktin tamponu hazirandi. - 5 mM K-Fosfat - 0,5 mM ATP - 0,1 mM CaCl2 - 0,5 mM DTT - 1 mM NaN3 Hazirlanan tamponun i�inde Tavsanin �izgili kas h�crelerinden elde edilen lifler 4-5 saat manyetik karistiricida ��z�l�r. ��z�len �rnek T�lbent bezden s�z�ld�kten sonra 0,5 lik filtreden ge�irildi. Elde edilen �rneklerin hacmine g�re 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl2 eklenerek gece polimerlesmeye birakildi.

75. Aktin Yapimi 5) �rnekler 80.000 x g de 4 saat santraf�j edildi. 6) Pelet alinir ve �zerine 2,5 ml depolimerlesme tamponu eklenir ve vortex ile pelet tampon i�inde ��z�ld�. 7) 29.000 x g de 45 dakika santrif�j edilen �rneklerden s�pernatant alinir. 8) Alinan �rnek G aktin tamponunda 4 saat dialize yatirilir. 9) Dializ edilen �rnekler elektroforez yapilarak G-aktinin olusup olusmadigi g�zlendi.

77. G-Aktin den F-Aktin eldesi Elde edilen aktine 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl2 eklenerek polimerlesmeye birakildi Polimerlesme sirasinda 0, 5, 10, 20, 60 dakilarda �rnegin vizkoslugu �l��ld�.

78. Bakteriden EF-2 Eldesi 1. Daha �nceden 180� C'de 2 saat kuru et�vde otoklavlanan cam kap i�ine 100 ml LS (50 ug/ml ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alinarak, 100 ml LB (w/amp) i�ine kontamine edildi. Gece boyunca 37� C'de shakerda sallanmaya birakilacakdi. 2. Ertesi sabah �nceden otoklavlanmis cam kaplar i�ine 500 ml LB (w/ampisilin) kondu. Gece boyunca �ogalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek sekilde konulduktan sonra 37 C'de shakerda sallanmaya birakildi. 3. �ogalan bakterinin yarim saatlik zaman dilimlerinde 600 nm'de OD degerleri �l��ld�. OD degeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 degerine ulasinca 0.1 mM olacak sekilde IPTG ve 20 ug/ml olacak sekilde 500 ml ampisilinli LB medyumu i�erisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve cloroamphenicol eklemeden hemen �nce daha sonra poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amaciyla 0. saat i�in 1 ml �rnek alindi. 4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca ink�basyona birakildiktan sonra, 4. saatin sonunda poliakrilamid jelde kullanmak �zere 1 ml �rnek alindi. 5. Buz i�inde konulan veya santrif�j godelerine aktarilan bakteriler 3500 rpm'de 4 C'de 10 dakika boyunca santrif�j edilip bakterilerin ��kmesini saglandiktan sonra 2 ml lyzis bufferda ��z�ld�. 6. Sonikat�rde buz i�indeyken 40-60 saniye kadar s�t beyazi rengine olana dek tutulup daha sonra -20 C'ye kaldirildi. 7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat i�in aldigin �rnekleri y�r�t�p coommassie boyama yaparak protein elde edilip edilmedigini kontrol edildi. 8. istenen protein poliakrilamid jelde g�r�ld�kten sonra, p�r�fikasyon asamasina ge�ildi.