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REAL TIME PCR

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13 diapositives · 445 Views · Aug 14, 2014

REAL TIME PCR. USING SYBR GREEN Courtesy of Dr. Hunt University of South Carolina. OVERVIEW. tissue. extract RNA. copy into cDNA (reverse transciptase). do real-time PCR. analyze results. REAL TIME PCR. kinetic approach early stages while still linear. www.biorad.com.

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REAL TIME PCR
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Transcription de la présentation
  1. REAL TIME PCR USING SYBR GREEN Courtesy of Dr. Hunt University of South Carolina

  2. OVERVIEW tissue extract RNA copy into cDNA (reverse transciptase) do real-time PCR analyze results

  3. REAL TIME PCR • kinetic approach • early stages • while still linear www.biorad.com

  4. SYBR GREEN CHEMISTRY SS-DNA DS-DNA

  5. SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

  6. DDCt EFFICIENCY METHOD APPROXIMATION METHOD

  7. IL1-b vit RPLP0 con RPLP0 vit IL1-b con

  8. control D Ct = target - ref RPLP0 con D Ct = 9.70 IL1-b con av =19.93 av =29.63 D Ct = target - ref experiment IL1-b vit D Ct = -1.7 RPLP0 vit Difference = DCt-DCt = DDCt = 9.70-(-1.7) = 11.40 av =18.03 av =19.80

  9. DDCt = 11.40 for IL1-beta • 2 DDCt variant: assumes efficiency is 100% Fold change = 211.40 = 2702 • But our efficiency for IL1-beta is 93% • Fold change = 1.9311.40 = 1800 • Pfaffl equation corrected for RPLP0 efficiency • Fold change = 1901