Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine

1. Présentation des travaux de thèse Vendredi 10 Avril 2009 LRBB Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Septembre 2007 – Août 2010 Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine Site de Recherche de Pierroton 33612 CESTAS Co-directeurs: Pauline Garnier-Géré Antoine Kremer

2. Plan de l’exposé I. Présentation du sujet – Problématique Spéciation sympatrique et flux de gènes Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Des divergences phénotypiques Une faible divergence moléculaire II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Objectif et principe Le dispositif Réalisation des croisements Mesures cytologiques Résultats Perspectives III. A la recherche des gènes de spéciation Objectif Choix des GC Résultats Le cas du locus S Perspectives

3. Plan de l’exposé • Présentation du sujet – Problématique

4. Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique (en rouge: barrières reproductives) I. Présentation du sujet – Problématique

5. Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique Interaction entre flux de gènes et divergence (en rouge: barrières reproductives) I. Présentation du sujet – Problématique

6. Spéciation sympatrique et flux de gènes Différents types de barrières à l’hybridation: FromLepais 2008 (PhD) I. Présentation du sujet – Problématique

7. Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique? Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu : Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence totale des génomes spéciation I. Présentation du sujet – Problématique

8. Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique? Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu : Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence totale des génomes spéciation Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives I. Présentation du sujet – Problématique

9. Spéciation sympatrique et flux de gènes Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives Quelques résultats en accord avec ce modèle: Savolainen & al., 2009 Nosil & al., 2009 I. Présentation du sujet – Problématique

10. Spéciation sympatrique et flux de gènes • - Etude de l’interaction entre les flux de gènes et la sélection divergente • Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ? Modèle d’étude: le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé I. Présentation du sujet – Problématique

11. Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Chêne sessile (Quercus petraea) et chêne pédonculé (Quercus robur) Aire de répartition sympatrique: Atlas Florae Europaeae 1999 Potentiel « hotspot » d’hybridation I. Présentation du sujet – Problématique

12. Un modèle de migration d’espèces Hybridation asymétrique: sessile (pollen)  pédonculé Bacilieri & al., 1996: Analyses de parenté Kleinschmit & al., 2000: Croisements contrôlés Expérience de Guy Roussel à l’INRA A la base d’un modèle de migration: of sessile Petit & al 2004 : Q. robur = espèce pionnière FromLepais 2008 (PhD) : Q. petreae = espèce en introgression

13. Des divergences interspécifiques Divergences écologiques  Types de sols Divergences morphologiques pH Pédonculé Sessile Dry Wet From Lepais (PhD) Rameau & al. 1994 Kremer et al. 2002 I. Présentation du sujet – Problématique

14. Une différenciation moléculaire très faible… • Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) • Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% • Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » I. Présentation du sujet – Problématique

15. Une différenciation moléculaire très faible… • Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) • Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% • Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » Toutefois, forte différenciation pour quelques marqueurs Ces marqueurs ont été cartographiés I. Présentation du sujet – Problématique Scotti-Saintagne et al., 2004

16. …mais des « hotspots » de différenciation • Cartographie des marqueurs: • Existence de régions génomiques (~15cM) plus différenciées entre les deux espèces •  En accord avec la vision génique de la spéciation proposant un modèle de génome en mosaïque structuré en régions différenciées et perméables aux flux de gènes, dans le cadre d’un processus de spéciation sympatrique Scotti-Saintagne et al., 2004 I. Présentation du sujet – Problématique

17. …mais des « hotspots » de différenciation • Limites des données actuelles: • Etudes anciennes avec marqueurs peu informatifs • Peu de données sur les fonctions des gènes dans les clusters différenciés • Au final, peu de données biologiques précises sur la compatibilité de l’hybridation • A quel niveau se situe ce complexe d’espèces dans le modèle de Wu ? I. Présentation du sujet – Problématique

18. Stratégie de recherche Objectif général: Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique I. Présentation du sujet – Problématique

19. Stratégie de recherche • Objectif général: • Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente • Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique • 2 approches parallèles: • Croisements contrôlés inter-spécifiques • Etude de la compatibilité d’hybridation entre différents génotypes • Recherche des gènes de « spéciation » impliqués dans la divergence • Approche gènes candidats • Etude de la diversité moléculaire et de la différenciation I. Présentation du sujet – Problématique

20. II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

21. Objectif et principe des croisements Objectif : Etudier la compatibilité d’hybridation entre les deux espèces Principe : Caractérisation de croisements hybrides en fonction de différents génotypes Croisements dans le sens le plus favorable: sessile vers pédonculé II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

22. Le dispositif Parcelle expérimentale de l’INRA à Bourran (Lot-et-Garonne) 2196 individus pédonculés âgés de 7 à 10 ans Arbres « plein-frères »: Descendants F1 du croisement intra-pédonculé 3P x A4 352 génotypes, présents de 7 à 10 copies (clones) Nombreuses données disponibles sur ces arbres (taille, croissance, débourrement, etc) II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

23. Les arbres du croisement ♀ ♂ Mélange pollinique sessile 4 individus sessiles en proportion 25% de grains viables (Qs27, Qs30, Qs31, Qs32) 30 arbres mères pédonculés 10 génotypes représentatifs de la variabilité du pédigrée 3 clones par génotypes II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

24. Les arbres du croisement Localisation des arbres sur la parcelle II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

25. Les étapes des croisements Protocole mis au point à l’INRA par Guy Roussel II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

26. Les étapes des croisements L’empochage des arbres  Isoler les arbres-mères du pollen environnant II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

27. Les étapes des croisements L’empochage des arbres  Isoler les arbres-mères du pollen environnant II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

28. Les étapes des croisements Les piqûres de pollen  Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

29. Les étapes des croisements Les piqûres de pollen  Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

30. Les étapes des croisements Dépochage, mesures, prélèvements  De Mai à Septembre II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

31. Mesures cytologiques Objectif : Observation des tubes polliniques en croissance dans les styles Protocole fourni par Adrienne Ressayre Basé sur une coloration au bleu d’aniline (callose) Microscopie à fluorescence (UV) Prélèvements et conservation dans le FAA II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

32. Croisements contrôlés : Variables mesurées Identification Morphologie Phénologie Succès des croisements Cytologie II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

33. Croisements contrôlés : Analyses de variance • 4 modèles d’analyse de variance utilisés: • « Effet génotype seul » • Yij = µ + Gi + Eij • Valeur moyenne effet génotype erreur • « Effet génotype + bloc » • Yij = µ + Gi + Bj + Eijk • Valeur moyenne effet génotype effet bloc erreur • « Analyse de covariance » • Yik = µ + Gi + β COVik + Eik • Valeur moyenne effet génotype covariance erreur • « Analyse de covariance hiérarchisée » • Yik = µ + Gi + βi COVik + Eik • Valeur moyenne effet génotype covariance erreur : Effet génotype : Effet environnement II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

34. Croisements contrôlés : Analyses de variance Effet génotype significatif II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

35. Croisements contrôlés : Analyses de variance Nécessité de déclarer des covariables représentant les hétérogénéités de l’environnement pour mettre en évidence les effets génotypes  Augmentation de la puissance des tests II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

36. Croisements contrôlés : Analyses de variance Contribution des effets sur la somme des carrés d’écarts totaux sur la moyenne finale II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

37. Croisements contrôlés : Résultats

38. Comparaison avec les témoins naturels • Plus d’inflorescences pour les arbres empochés • Influence de la poche qui favoriserait la floraison? • Plus de grains de pollen sur les fleurs pour les témoins naturels • Plus longue exposition au pollen chez les témoins? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

39. Comparaison avec les témoins naturels • Pour la même date de prélèvement, les tubes polliniques sont plus développés chez les témoins naturels • Ralentissement de la croissance des tubes • Existence de barrière pré-zygotique ? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

40. Corrélations entre variables (140) (116) (116) • Relations positives, artificiellement créées ? • Manque de points intermédiaires • A confirmer en 2009  Augmentation des mesures • Pas de conclusions possibles à ce stade II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

41. Et côté paternel ? • Génotypage des glands obtenus pour déterminer le père de chaque gland • 336 glands génotypés avec 12 microsatellites • Pas de résultats à présenter aujourd’hui (il manque un parent) • Type de résultats attendus: • Objectif : Données sur de possibles différences de compatibilité selon le génotype de chêne sessile II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

42. Croisements contrôlés : Conclusions • Différences significatives entre les génotypes d’arbres mères pour les variables mesurées • Différences entre les génotypes pour la compatibilité d’hybridation • Moins bonne croissance des tubes polliniques lors des croisements hybrides • Détection de barrières pré-zygotiques • A confirmer: corrélations entre variables cytologiques et « macrovariables » • Détection de barrières pré-zygotiques ? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

43. Croisements contrôlés : en 2009 • Génotypage des glands • Suivi des glands  Données sur barrières post-zygotiques? • Les croisements et les mesures cytologiques réalisés en 2008 ont bien fonctionné et nous ont apporté des infos •  Nouveaux croisements 2009 à plus grande échelle: • Augmentation du nombre de croisements hybrides • 19 génotypes * 3 clones • 2 génotypes « ponts » • Croisements intra-pédonculés • Témoins empochés • 10 génotypes * 1 clone Croisements intra-pédonculés Suivi de témoins naturels 19 génotypes * 3 clones Pollen sessile Pollen pédonculé Pollen naturel II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

44. Croisements contrôlés : en 2009 Suivi de 124 arbres, dont 66 empochés la semaine dernière : Merci à Guy, Benjamin, et à l’Unité Expérimentale de Bourran II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

45. Plan de l’exposé • A la recherche des gènes de spéciation • Analyse de séquences nucléotidiques de gènes candidats

46. A la recherche des gènes de spéciation • Objectif : • Détection de gènes candidats potentiellement impliqués dans la divergence entre les deux espèces • Principe : • Analyse de séquences nucléotidiques : diversité et différenciation inter-spécifique • Focalisation sur les gènes potentiellement impliqués dans les barrières à l’hybridation • Détection de gènes « outliers » par rapport à une référence expérimentale « neutre » basée sur l’étude d’un grand nombre de fragments (projet de reséquençage) III. A la recherche des gènes de spéciation

47. Choix des gènes candidats III. A la recherche des gènes de spéciation

48. Fragments séquencés • Gene Pop2: • Précurseur d’une sous-unité de la gamma-aminobutyrate transaminase • Contrôle du guidage du tube pollinique • Longueur du gène chez At = 5,3kb, 13 introns • 1 fragment obtenu sur 13 testés • Gene Tub8: • Sous unité alpha de la tubuline 8 • Longueur du gène chez At = 1,8kb • 2 fragments obtenus sur 4 testés • Gene H8: • Récepteur glycoprotéique • Screené avec un fort Gst dans la banque • 2 fragments obtenus sur 2 testés III. A la recherche des gènes de spéciation

49. Fragments séquencés • Gene Feronia: • Récepteur à activité kinase exprimé dans les synergides • Contrôle de l’interaction pollen-pistil chez At • 3 paralogues détectés chez le chêne, 1 séquencé • 1 fragment obtenu sur 4 testés • Gene ROS: • Récepteur exprimé dans le pollen • Screené avec fort Gst dans la banque • 1 fragment obtenu sur 1 testé III. A la recherche des gènes de spéciation

50. Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation