PCR em Tempo Real

1. PCR em Tempo Real RT- PCR em Tempo Real PCR quantitativo

2. PCR em Tempo Real Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão de um fluorescente

3. PCR em Tempo Real Quantificação em gel x Real-Time PCR: “Relação quantitativa entre quantidade de DNA inicial e a quantidade de produto durante a fase exponencial de um programa de ciclagem”

4. Detector de sequências a laser, totalmente automatizado

5. PCR em Tempo Real Requerimentos específicos da técnica • Equipamento de leitura da amplificação; • Química específica de fluorescência na reação; • Método matemático de correlação; • Uso de soluções-padrão ou genes de referência.

6. PCR em Tempo Real Experimentação • reação em branco, (H2O); • diluição serial (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5); • amostras • primers: gene de interesse x gene de referência • em triplicatas !!!

7. PCR em Tempo Real Baseline Ct • - linha basal: não houve clivagem suficente do corante-repórter para que se possa detectar a fluorescência • fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo • fase platô: não há mais aumento no número de amplicons

8. Piso de Fluorescência: threshold cycle Ct Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

9. Ct No ponto referido como Ct a fluorescência aumenta acima da linha basal, de forma exponencial. Amostras mais concentradas (com maior no de templates iniciais) mostram valores menores de Ct. Esse fenômeno criou um novo paradigma para quantificação por PCR: é avaliado o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.

10. Curva de diluição • Uso como referência absoluta (se for o caso); • Cálculo de eficiência da reação de PCR;

11. Curva de diluição Ct ng/ul log

12. Genes de referência (housekeeping)

13. Curva de desnaturação (melt curve)

14. Químicas de Fluorescência em Tempo Real • especificidade requerida • escala de aplicação • custo • experiência do laboratório • leitura do aparelho

15. Químicas de Fluorescência em Tempo Real Sybr-Green

16. Químicas de Fluorescência em Tempo Real TaqMan Sonda FRET:FluorescentResonanceEnergyTransferQuencher (repressor)Atividade 5’ exonuclease da DNA polimerase

17. O sistema de quantificação em tempo real tem tido as seguintes aplicações: 1 - Análise da expressão gênica - RNA total (RT-PCR) 2 - Identificação de alelos em DNA genômico 3 - Análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes 4 - Análise de patógenos em alimentos 5 - Análise de produtos transgênicos, etc.... O sistema permite a detecção simultânea de até 3 fluorocromos diferentes, de modo que o controle interno ou externo pode ser analisado simultaneamente à analise da molécula alvo.

18. RotorGene 3000 (Corbett)

19. Real Time PCR Mede o aumento do sinal de fluorescencia proporcional a qtidadeDNA produzido durante cada ciclo da PCR Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.

20. Sequenciamento de DNA Gel radioativo Dideoxinucleotídeos ACG T Sanger, 1977