16. VAJA: GLIKOGEN
GLIKOGEN: • pri živalih predstavljarezervo glukoze(pri rastlinah – škrob;kvasovke in bakterije - dextran); • je polimerα(1→ 4)povezanih D-glukoz, na vsakih 8 – 12 ostankov se razvejazα(1→6)glikozidno vezjo; • molekulska masa glikogena znaša tudi do 2×107 Da in vsebuje do 100.000 glukoznih enot.
GLIKOGEN: • je shranjen vcitoplazmi celic v obliki intracelularnih zrnc - granul • velikost zrnc od 100 – 200 ×106 Da
VSEBNOST GLIKOGENA V JETRIH ŽIVALI:
GLIKOGEN: • zrnca glikogena vsebujejo tudiencime, ki katalizirajo tako sintezo glikogena (glikogeneza) kot razgradnjo glikogena (glikogenoliza) terproteine, ki nadzorujejo celoten proces.
GLIKOGEN MIŠICE: JETRA: • 1-2% granul, a glede na celotno mišično maso predstavlja poglavitno zalogo OH • zagotavlja metabolno E za sintezo ATP, ki se porablja za delo mišic • do 10% granul • vzdrževanje normalne koncentracije glukoze v krvi (3,6 – 6,1 mM) • zadošča za 12-24 ur, odvisno od aktivnosti osebka
Glikogen: (Glc)n (Glc)n-1 Glikogenoliza: Pi Glikogen fosforilaza Glc-1-P v jetrih: Fosfoglukomutaza Glc-6-fosfataza v mišicah: Glc-6-P glukoza Glikoliza Pi laktat piruvat Piruvat dehidrogenaza Laktat dehidrogenaza CO2 v rdečih mišičnih vlaknih v belih mišičnih vlaknih Acetil-CoA Cikel citronske kisline CO2 + H2O
RAZGRADNJA GLIKOGENA: • glukoza se mobilizira zglikogen fosforilazo, ki z zaporedno cepitvijo iz nereducirajočega konca glikogena odceplja glukoza-1-fosfat.
Debranching enzyme action:
Glycogen storage diseases
Vrednosti glukoze v krvi pri domačih živalih: človek: 4,48 – 6,72 80 - 120
IZOLACIJA IN DOLOČANJE GLIKOGENA IZOLACIJA GLIKOGENA IZ PODGANJIH JETER Princip: • Glikogen pri nizkem pH hidrolizira, v alkalnem pH pa je stabilen! • Iz 30 % raztopine KOH ga lahko oborimo s 70 % etanolom!
IZOLACIJA IN DOLOČANJE GLIKOGENA IZOLACIJA GLIKOGENA IZ PODGANJIH JETER 0,5 g jetrnega tkiva + 1,5 mL 30 % KOH, premešaj 30 – 60 min na 100 oC ohladi (najprej z vodo, nato na ledu) dodaj 3 mL 95 % etanola in 0,25 mL nasičene razt. (NH4)2SO4, premešaj postavi na vodno kopel, da zavre ohladi (najprej z vodo, nato na ledu)
centrifugiraj 10 min, 2000 obr/min supernatantoborina zavrzi 1 × speri: dodaj 3 mL 95 % etanola, dobro premešaj centrifugiraj 10 min, 2000 obr/min supernatant oborina (glikogen) zavrzi raztopi v dH2O (lačna p. 5 mL, sita p. 200 mL)
IZOLACIJA IN DOLOČANJE GLIKOGENA DOLOČANJE KONCENTRACIJE GLIKOGENA Vzorci: • lačna podgana: 1 mL raztop. oborine • sita podgana: 1 mL raztop. oborine • standard: 1 mL standardne raztopine glukoze (25, 50, 100 g glukoze/mL) • slepa proba: 1 mL dest. vode Postopek: • 1 mL vzorca (lačna, sita podgana, standard, slepa proba) med mešanjem na ledeni kopeli počasi dodajaj 5 mL antronskega reagenta. • Zmes segrevaj 10 min v vreli vodni kopeli. • Ohladi in izmeri absorbanco pri 620 nm! Rezultat: • S pomočjo standarda izračunaj koncentracijo glukoze in jo izrazi v mg glukoze na 1 g jetrnega tkiva!
DOLOČANJE GLUKOZE V KRVI PRIPRAVA VZORCA ZA DOLOČANJE GLUKOZE 1 mL seruma + 2 mL TCA centrifugiraj 20 min, 3000 obr/min oborinasupernatant (plazemski proteini) (vzorec)
DOLOČANJE GLUKOZE DOLOČANJE GLUKOZE - Standard: 1 mL standardne raztopine glukoze (1 mg/mL in 0,5 mg/mL) + 2 mL TCA - Slepa proba: 1 mL dest. vode + 2 mL TCA Postopek: • 0,5 mL supernatanta, standarda in slepe probe dodaj 5 mL anilina v ledocetni kislini. • Segrevaj 10 min na 100 oC (vrela vodna kopel). • Izmeri absorbanco pri 625 nm. Rezultat: • Koncentracijo glukoze v serumu določi s pomočjo standarda (umeritvena krivulja) in jo izrazi v mmol/L krvi!
