Luis Gustavo Carvalho Pacheco Orientador: Prof. Dr. Vasco Azevedo Co-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo

1. IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14. Luis Gustavo Carvalho Pacheco Orientador: Prof. Dr. Vasco Azevedo Co-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo

2. LABORATÓRIOS • Genética Celular e Molecular (LGCM), Dep. de Biologia Geral. • Taxonomia e Biologia de Invertebrados, Dep. de Parasitologia. • Imunologia das Doenças Infecciosas, Dep. de Bioquímica e Imunologia.

3. PLANO DE APRESENTAÇÃO INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES AGRADECIMENTOS

4. VACINA DE DNA • Histórico e conceito • Mecanismos de indução de resposta imunológica. • Vias de administração.

5. BACTÉRIAS CARREADORAS • Vantagens. • Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais. • Trabalhos com gene repórter. • Outras doenças.

6. Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.

7. ESQUISTOSSOMOSE • Vermes do gênero Schistosoma • Problema sócio-econômico e de saúde pública • Pessoas em risco: quase 800 milhões • Pessoas infectadas: cerca de 200 milhões • No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) • Ciclo biológico (BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)

8. CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp. www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ Frames/S-Z/Schistos...

9. ESTRATÉGIAS DE CONTROLE • Saneamento básico • Quimioterapia: oxamniquina e praziquantel • Re-infecção em áreas endêmicas • VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)

10. CONCEITO DE VACINA PROTETORA • Diferente do normalmente associado com vacinas. • Imunidade parcial: • diminuição da carga parasitária. • menos ovos acumulados = redução da reação granulomatosa. • menos ovos liberados para o ambiente. (BERGQUIST et al., 2002)

11. CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS • Natureza provável da resposta imunológica: • dicotômica: células Th1 e Th2 • variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito. (AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)

12. CANDIDATOS VACINAIS • 6 antígenos de Schistosoma escolhidos pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante. • Sh28GST em fase mais avançada de estudos: • BILHVAX (proteína recombinante) • diminuição de fecundidade • fase II de testes clínicos

13. SM14 • FABP (fatty acid-binding protein). • Aquisição e utilização de ácidos graxos por diferentes organismos. • Vacina bivalente anti-helmíntica. (TENDLER et al., 1996) • Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO et al., 2002)

14. OBJETIVO GERAL • Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.

15. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal. • Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. • Ensaios de imunização oral de camundongos SWISS. • Avaliar produção de anticorpos. • Avaliar proteção conferida aos camundongos contra a esquistossomose experimental.

16. MATERIAIS E MÉTODOS Salmonella typhimurium SL3261 pCMV Amp pCI-neo TRANSFORMAÇÃO pCI-Sm14 pCMV Amp CURVAS DE CRESCIMENTO SEQUENCIAMENTO RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

17. 7 doses de 109 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias. Diluição1\50 Imunização com 100 µl Meio + Antib. + Bactéria O.N. 4:30 hs depois O.D. 0,8-0,9 Concentração (5 X 109 UFC/ml) Fase estacionária Fase exponencial Meio da fase exponencial ... 10-7 10-1 10-2 (~10-8 a 10-9 UFC/ml) ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

18. MATERIAIS E MÉTODOS 3 ANÁLISES DE PROTEÇÃO 1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL 2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES

19. DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14 • Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PM 5000pb 2000pb 1000pb 400pb CANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I

20. CURVAS DE CRESCIMENTO 2,36 x 109 4,75 x 105 5,54 x 108 1,6 x 105 8,9 x 108 8,3 x 108 6 x 108

21. ANÁLISES DE PROTEÇÃO

22. PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

23. Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos.

24. Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

25. 15 30 45 60 75 90 * 15 30 45 60 75 90 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORALPRODUÇÃO DE IgG anti-Sm14 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

26. CONCLUSÕES • Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni. • A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.

27. AGRADECIMENTOS • Pai, mãe e irmãos. • Amigos de BH (Pterodactilo’s Corporation); Amigos de Sete Lagoas; Carol. • Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. • Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. • Pessoal do LIDI e do Lab. Imunoparasitologia. • Pessoal da Biologia e da Genética.

28. Candidatos vacinais contra a esquistossomose

29. VACINA DE DNA

30. VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

31. MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS CARREADORAS WEISS & CHAKRABORTY, 2001.

32. ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA

33. 1798 Varíola 1981 Hepatite B 1992 VACINAS DE 1ª GERAÇÃO VACINAS DE DNA 2ª GERAÇÃO