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Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen

Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen. Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider.

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Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen

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Presentation Transcript

  1. Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider D. Wuttig1, B. Baier 2, S. Fuessel 1, M. Meinhardt 3, S. Zastrow 1, C. Höfling 1, M.-O. Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 2, M.P. Wirth 1 1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden 2 Fachkrankenhaus Coswig, Zentrum für Pneumologie, Beatmungsmedizin, Thorax- und Gefäßchirurgie 3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden gefördert von der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung

  2. metastatic colonization dormancy Nierenzellkarzinom und Metastasierung • Nierenzellkarzinom (NZK) • dritthäufigster urologischer Tumor • Dtl.: 10.000 Neuerkrankungen/Jahr [RKI, Stand 11/2004] • urolog. Tumor mit höchster prozentualer Todesrate  Metastasen (60% der Patienten; 50-60% in Lunge)  medianes Überleben: 6–12 Monate • Metastasierung • metastasierungs-assoziierte Faktoren: Angiogenese, Zelladhäsion, Invasion, Migration [http://www.nccr-oncology.ch] Einleitung

  3. Zielstellung • Zielstellung • molekulare Faktoren, die mit Ausbildung variierender DFI und verschiedener Mets-Zahlen assoziiert (Microarray-Analysen) • Untersuchung pulmonaler Mets (1318nm Nd-YAG-Laser, FKH Coswig) Hypothese • Patienten mit frühen (synchronen) Mets sowie Patienten mit multiplen Mets haben extrem schlechte Prognose • molekulare Ebene: „aggressivere“ Tumorherde (höhere Proliferationsrate, aktivierte Angiogenese, bessere Fähigkeit zu Anlagerung und Anwachsen in Sekundärorganen) • Untersuchungsmaterial • 20 kryokonservierte Lungen-Mets von 18 Patienten mit klarzelligem NZK • homogenes Patientenkollektiv: Nephrektomie, keine anderen Tumoren, nur operative Therapien (außer 1 Pat.), klin. keine distanten Mets vor Lungen-Mets-Diagnose Zielstellung

  4. 25nt-Sonden auf Glasmatrix Oligonukleotid-Microarrays: Methodik und Auswertung • HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix), 47.400 Transkripte (38.500 Gene) • Probenaufarbeitung Gewebeschnitte  RNA  cDNA  biotinylierte cRNA  Fragmentierung • Hybridisierung und Waschen • Scannen - Detektion via Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (750 nm) - Fluoreszenzsignal  Transkriptmenge • Auswertung (Software: RMAExpress) - globale Background-Korrektur, Quantil-Normalisierung - Signalberechnung, Logarithmieren (Pseudonormalisierung) - differenziell exprimierte Transkripte: Fold Change = MW Gruppe 1 / MW Gruppe 2 ≥ |1,8| (t-Test, FDR<0,05) Material & Methoden

  5. DFI ≥ 5 years DFI ≤ 9 months DFI ≤ 9 months DFI  5 years Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI I Gruppeneinteilung:frühe vs. späte Metastasen • DFI ≤9 Monate(0-9 Mon., Med=1 Mon.; n=5)vs. DFI 5 Jahre(60-156 Mon., Med=92,5 Mon; n=6)  306 differenziell expr. Transkripte („späte Mets“: 279, 27; 414 Sondensets) Visualisierung: Principal component analysis, heat map (Auszug) Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

  6. unerwartet, da Patienten mit „frühen Mets“ schlechtere Prognose haben Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte • Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) • Motilität / Migration der Zellen • Zelladhäsion • Angiogenese aktiviert in „späte Mets“ (z.B. KDR, PDGFB, PDGFA, PDGFRB, ETS1, CD31) Literaturrecherche • lt. Literatur 73/306 (47%) metastasierungsassoziiert  75% in „späten Mets“ reguliert wie für Tumoren beschrieben  „späte Mets“ weisen höheres metastatisches Potential auf als „frühe Mets“ Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

  7. molekularen Unterschied zwischen synchronen und metachronen Mets Tumorbiologische Ursache? • 306 Gene (414 Sondensets)  Vorhersagemodell (k-nearest neighbouring) 8 Mets (DFI = 11 – 30 Monate) späte Mets (DFI ≥ 5 Jahre) frühe Mets (DFI ≤ 9 Monate) 1/8 Mets (DFI=15 Monate) 7/8 Mets (DFI=11 - 30 Monate) •  Theorie • Primärtumor bei Mets-Wachstum noch anwesend und somit selbst in der Lage zur Metastasierung  metastatisches Potential der Mets gering • Primärtumor bereits entfernt bei Beginn des Mets-Wachstums  Mets entwickeln von Beginn an höheres Metastasierungspotential Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

  8. viele Mets wenige Mets viele Mets wenige Mets Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl I Gruppeneinteilung:wenige vs. viele Metastasen • ≤8(1-8, Med=3, n=10)vs. 16(16-80, Med=24, n=7) Lungen-Mets/Pat. (klinisch: längeres Überleben für ≤9 vs. >9 Mets) [Rolle et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2006] • 135 differenziell exprimierte Transkripte („viele MS“: 50, 85; 163 Sondensets) Visualisierung: Principal component analysis, heat map Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

  9. Grund für Unterschiede in MS-Anzahl sind möglicherweise verschiedene Wachstumseigenschaften der Tumorzellen Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte • Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) • Zellteilung und Zellzyklus (z.B. PBK, Survivin, PTTG1)  aktiviert in „viele Mets“ Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

  10. Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential Erstellung von Vorhersagemodellen • Ausgangspunkt: Sondensets, deren differenzielle Expression mit zwei weiteren mathematischen Algorithmen validiert (GCOS, dCHIP) • k-nearest neighbouring, weighted voting Vorhersagemodell zum DFI (11 + 1 Mets) • 6-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung einer weiteren Proben Vorhersagemodell zur Metastasenanzahl (17 + 3 Mets) • 11-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung dreier weiterer Proben Ergebnisse: Vorhersagemodelle

  11. (n=6) (n=7) (n=5) (n=10) Fold Change=5,5 p=0,004* Fold Change=2,7 p=0,001* viele Mets wenige Mets Validierung der Microarray-Ergebnisse • Expression von 6 Genen mittels quantitativer PCR validiert (TBP, DDCP) PTTG1 (pituitary tumor-transforming 1) GALNTL2 Überexpression relativ zu fiktiver Probe mit DCP=0 Array: Fold Change=2,1 p=0,002 Array: Fold Change=3,4 p=0,002 (n=11) (n=10) (n=8) (n=19) Fold Change=2,5 p=0,002* Fold Change=5,1 p=0,001* späte Mets frühe Mets ( Median; * zweiseitiger t-Test basierend auf log2-Daten) Ergebnisse: Validierung

  12. Zusammenfassung und Ausblick Zusammenfassung • molekulare Unterschiede verschiedener Mets-Charakteristika: •  verschiedene DFI spielgeln sich in unterschiedlichem metastatischen • Potential der Mets wider •  verschiedene Mets-Zahlen aufgrund variierendem Wachstumspotentials • Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential • Ausblick • Primärtumoren einbeziehen: Microarrays, Validierung (qPCR, Immunhistochemie) •  prognostisch relevante Gensignaturen  Therapieregime anpassen

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