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“Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-05). Carles J. Ciudad . Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB. (cciudad@ub.edu). Una Vieja Idea con una tecnología moderna.
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“Arrays de cDNA”Curso de PostgradoGenómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-05) Carles J. Ciudad. Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB. (cciudad@ub.edu)
Una Vieja Ideacon una tecnología moderna • Determinar la expresión génica a mRNA • Un Array es un Multi-Northern • Técnica basada en la hibridación • Arrays (250-8000 genes), tamaño grande. Marcaje radiactivo • Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro. Marcaje fluorescente
APLICACIONES DE LOS ARRAYS • DEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano) • ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis) • INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos) • DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS
NATURALEZA DE LOS ARRAYS • LO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli) • CADA cDNA CONTIENE 200-600bp, (10ng)(AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY) • SON ESPECÍFICO DE ESPECIE • CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS(PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), YPOSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR
METODOLOGÍA DE UN ARRAY • ATLAS HUMAN CANCER 1.2K • Membranas de Nilón (8X12cm): 1176 GENES • Cada cDNA (10 ng, 200-600 bp) • Específicos de Especie • Sin secuencias repetitivas o de alta similaridad. • MARCAJE cDNA • a-[32P]-dATP • MMLV-RT • Primers específicos • Purificación G-50 • Hibridación • ANALISIS • “Phosphorimaging” • Normalización • Interpretación resultados
NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYS • LAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION • DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs • NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES • NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)
CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ? • GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES) • EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)
K562 (Leucemia mieloide crónica) HT29 (Cáncer de colon) I. Análisis genómico de los cambios de expresión II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato Genómica de la resistencia al MTX
CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS
COMPROBACION DE LOS RESULTADOS • RT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos) • NORTHERN ANALYSIS • RNAse PROTECTION • WESTERN ANALYSIS • ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D
300 250 200 150 Niveles de mRNA para la IMPDH (% respecto el control) 100 50 0 CNT 3x10-8 M 3x10-7 M MTX (M) Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h Validación de los resultadospor RT-PCR cuantitativa IMPDH2 APRT
CONH2 CONH2 S N O O OH OH OH OH OH OH BENZAMIDA RIBÓSIDO TIAZOFURINA SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOS ADENILSUCCINATO LIASA ADENILSUCCINATO SINTETASA AMP ADENILSUCCINATO IMP IMPDH XANTILATO GMP INHIBIDORES DE LA IMPDH CH3 HO O HO O O CH3O CH3 ACIDO MICOFENÓLICO
CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX 1 2 0 1 0 0 M T X + B R 8 0 6 0 B R 4 0 M T X 2 0 0 C O N T R O L 1 0 - 7 M 3 X 1 0 - 7 M 1 0 - 6 M 3 X 1 0 - 6 M 1 0 - 5 M BENZAMIDA RIBÒSID (M) BENZAMIDA RIBÒSID
HT29 CONTROL HT29 RESISTENTES A 10-5 M EXPERIMENTO HT29 RESISTENTES AL MTX
CELL CYCLE - c e ll d ivisi on p rote in ki na s e 5 ( CD K 5 ) - NE D D5 prot ei n ho m o l og O NC OG EN E S AND T UM O R S UPR E SS O R S - m e ta s ta sis s u p pre ss o r k ang ai 1; - s hb p rot o -on c o g ene - c - myc pu r i n e-b i n di ng tr a n sc r i pt i o n fa c to r puf SYNTHESIS DNA REC OM B I NA TI O N A ND RE P A I R - p r o li ferat in g cyclic nu cl ea r ant i g e n ( PCN A ) ; I N T RACE L LU L AR T RANSDU C ER - B - c e ll r ec epto r -a ss o ci a t ed p r ote i n ( h B A P ) T RANS L AT IO N - e l on g at i on f ac tor 1 a l pha ( E F 1 a lp ha) P OS T - TR A NSCR I P T I O N A L MO D I F I CAT IO N - p r oge s te r one r e c ept o r- ass o ci ated P 48 prot ei n Genes sobreexpreados en tratamientos cortos y en células HT29 resistentes al Metotrexato 9 genes sobreexpresados tratamiento 24h resistentes 9 38 15 1123
Genes infraexpreados en tratamientos cortos y en células resistentes al Mtx 27 genes infraexpresados tratamiento 24h resistentes 28 11 73 1073
Efecto de la sobreexpresión de Vimentina sobre la resistencia al Mtx CÉLULAS HT29 RESISTENTES A 10-5 M MTX MTX 10-5 M 120 100 80 SUPERVIVENCIA (% RESPECTO CONTROL) 60 40 MTX 10-5 M + vimentina 20 0 0 0,1 0,3 1 3 VIMENTINA TRANSFECTADA (µg)
TIPOS DE ARRAYS REALIZADOS • ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS CAMBIOS DE EXPRESIÓN QUE TIENEN LUGAR EN CÉLULAS TRATADAS O RESISTENTES AL METOTREXATO. • ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS PROCESOS APOPTÓTICO Y ANGIOGÉNICO (MERCK-FARMA) • ANÁLISIS GENÓMICO DE DIFERENTES ESTADIOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (R.Franco) • ANÁLISIS GENÓMICO DE DROGAS HIPOLIPEMIANTES (JC Laguna) • IDENTIFICAR POSIBLES DIANAS PARA UN TRATAMIENTOS ESPECÍFICOS EN CADA CASO.
