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2007 Desarrollo Profesional

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  1. 2007 Desarrollo Profesional

  2. Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Instructores Essy Levy, M.S. Coordinadora de Programas de Hughes Scholars UCSD, San Diego CA Julie Mathern BioEducation Product Manager Bio-Rad Laboratories, Hercules CA

  3. ¿Para que enseñarla transformación genética? • Una herramienta poderosa para el aprendizaje • Parte de los estándares nacionales curriculares • Varias extensiones de practicas de laboratorio • Conexiones con el mundo real • Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria

  4. Dogma Central de la Biología Molecular ADN ARN Proteína Característica

  5. Conexiones con el mundo real • GFP es un marcador visual • Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas) • Localización y regulación de la expresión de un gen • Movimiento celular • El destino celular durante el desarrollo • Formación de los diferentes órganos • Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

  6. Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™ Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad • Basado en los estándares curriculares • Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento • Compatible con un periodo de clase de 50 minutos • Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo) • Costo económico • Resultados exitosos en las manos de los estudiantes • Seguro para uso en el aula • ¡Resultados tangibles!

  7. ProcedimientoTransformación Day 2 Day 1

  8. Horario para el Taller de GFP • Introducción • Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO • Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

  9. Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

  10. ¿Que es una transformación? Absorción de ADN exógeno; frecuentemente un plásmido circular GFP Lactamasa beta Resistencia a la Ampicilina

  11. ¿Que es un plásmido? Un pedazo circular de ADN que se replica autónomamente Evolucionado originalmente en bacterias Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés

  12. Las diferentes caras de un plásmido Micrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica

  13. Plásmido pGLO • Lactamasa Beta -Resistencia a la ampicilina • La proteína GFP (Green Fluorescent Protein) • Aequorea victoria gen de medusa • araC: Regulador Regula la trascripción de GFP

  14. Transformación con pGLO Pared celular GFP Cromosoma Bacteriano (ADN) Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO

  15. ADN Bacteriano Célula de Bacteria Plásmido de ADN ADN Geonómico

  16. Regulación de Trascripción • Operón de lactosa • Operón de Arabinosa • Plásmidos de pGLO

  17. Regulación de Trascripción Operón ara Operón lac araC B A D LacI Z Y A Efector (Arabinosa) Efector(Lactosa) araC B A D LacI Z Y A ARN Polimerasa ARN Polimerasa B A D araC Z Y A

  18. Regulación de la expresión del gen Operón GFP Operón ara araC Gen de GFP araC B A D Efector(Arabinosa) Efector (Arabinosa) araC Gen de GFP araC B A D ARN Polimerasa ARN Polimerasa B A D araC araC Gen de GFP

  19. Métodos de Transformación • Electroporación • Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN • Cloruro de Calcio y Choque Térmico • Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico

  20. Proceso de Transformacion • Suspender las colonias en la Solución de Transformación • Añadir el plásmido pGLO ADN • Incubar los tubos en hielo ice • Choque térmico a 42°C y colocar en hielo • Incubar con caldo nutriente LB • Extienda la suspensión por la superficie de las placas

  21. ¿Porque es importante cada paso de la transformación? Ca++ O Ca++ O P O Base • La solución de transformación = CaCI2 La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN O O CH2 Azúcar O Ca++ O O P Base O O CH2 Azúcar OH

  22. ¿Porque es importante cada paso de la transformación? Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular 4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina)

  23. ¿Que es el caldo nutriente de LB? • Caldo Luria-Bertani (LB) • Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés • carbohidratos • aminoácidos • nucleótidos • Sales • Vitaminas

  24. LB/Amp LB/Amp/Ara LB ¿Crecer?¿Brillar? Siga el protocolo ¿En que placas crecerán colonias? ¿Que colonias brillarán?

  25. Medida de Volumen