Fluorimetrijsko određivanje klorofila α EPA Metoda 445.0

Fluorimetrijsko određivanje klorofila αEPA Metoda 445.0 Mr. sc. Danijela Peroš-Pucar, dipl. ing. biol. Anita Ivandić, dipl. ing. biol. Split, lipanj, 2008. Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju

Klorofil α Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Klorofil α je zeleni biljni pigment i čini 1 do 2% suhe težine planktonskih algi Intenzivan rast planktonskih algi, kao rezultat eutrofikacije, povisuje koncentraciju klorofila α - indikator biološke eutrofikacije

Klorofil α Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Koncentracija fotosintetskih pigmenata određuje se da bi se utvrdila biomasa fitoplanktona u eufotičkoj zoni vodenog stupca

Struktura klorofila α Struktura molekule klorofila je porfirinski sustav građen od 4 pirolna prstena.U središtu molekule nalazi se atom magnezija Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju

Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Ostali pigmenti koji se nalaze u fitoplanktonu su klorofil b i c, ksantofil, fikobilini i karoteni Produkti raspadanja klorofila koji se mogu naći u vodenom okolišu su klorofilidi, feoforbidi i feofitini.

Metode Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Tri metode koje se koriste za određivanje klorofila α u fitoplanktonu su: - spektrofotometrija (HRN ISO 10260) - fluorimetrija (EPA Method 445,0) - HPLC

Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Ova metoda osigurava determinaciju niske razine klorofilaα (chl α) i njegovih derivata koji su oslobođeni od magnezija, feofitina α (pheo α) u morskom i slatkovodnom fitoplanktonu upotrebljavajući detekciju fluoriscencijom.

Sažetak metode Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju

Aparatura i oprema Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Fluorimetar - Turner Designs Model TD700 Centrifuga ( minimalno 675 g) Homogenizator za tkivo Filteri sa staklenim nitima, 47-mm ili 25- mm, 0,7μm, Whatman GF/F Aparatura za membransku filtraciju Vakuum pumpa Pinceta Laboratorijsko suđe

Reagensi i standardi Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Aceton HPLC čistoće-90% Otopina 0,1 N HCl Klorofil α oslobođen od klorofila β. (Sigma Chemical)

Uzorkovanje Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju • Crpac, štap • zatamnjene boce • Volumen uzorka • Filitriranje – vrijeme - vakuum

Niskinov crpac – oceanografski instrument kojim se uzima uzorak morske vode na određenoj dubini Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju

Konzerviranje uzorka Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Filter s uzorkom se čuva smrznut na –20 ili –70 0C u tami sve do ekstrakcije. Filtri se mogu čuvati smrznuti na –20 ili –70 0C najviše tri i pol tjedna bez značajnog gubitka klorofila α.

Ekstrakcija uzorka Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju • Homogenizacija, • Centrifugiranje -15 min na 675 g ili 5 min na 1000g

Mjerenje Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju 5 ml ekstrakta – očitati Zakiseliti s 0,15ml 0,1N HCl

Analiza podataka i račun Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Koncentracija klorofila α u ekstrahiranom uzorku CE,c = koncentracija cklorofil α (μg/L) u ekstrahiranoj otopini koju analiziramo. Fs = odgovarjući faktor za osijetljivost, S r = omjer konentracije čistog klorofila α prije i poslije zakiseljavanja Rb = florecencija ekstrahiranog uzorka prije zakiseljenja Ra = florescencija ekstrahiranog uzorka poslije zakiseljenja

Analiza podataka i račun Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju Koncentracija klorofil α u cijelom uzorku vode CS,c = koncentracija klorofil α (μg/L) u cijelom uzorku vode ekstrahirani volumen = volumen (L) uzorka pripremljen prije razrijeđivanja DF- faktor razrijeđenja

Hvala na pažnji! Zavod za javno zdravstvo Zadar Služba za zdravstvenu ekologiju

Fluorimetrijsko određivanje klorofila α EPA Metoda 445.0