1 / 25

SDS － PAGE 测定蛋白质的相对分子量

SDS － PAGE 测定蛋白质的相对分子量. 【 基本原理 】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。. 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（ SDS ）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白质的分子量 。. SDS 的作用原理 SDS 是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分之间以及与其它物质分子之间的非共价键 , 使蛋白质变性而改变原有的空间构象 。.

nascha
Télécharger la présentation

SDS － PAGE 测定蛋白质的相对分子量

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量

  2. 【基本原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。

  3. 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白质的分子量。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白质的分子量。

  4. SDS的作用原理SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。SDS的作用原理SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。

  5. 蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。

  6. 同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭圆状。 因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。

  7. 当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。

  8. 【器材]电泳仪、垂直板电泳槽、进样器、乳头吸管、50ml小烧杯【器材]电泳仪、垂直板电泳槽、进样器、乳头吸管、50ml小烧杯

  9. 【试剂】1．标准蛋白质：2．30%丙烯酰胺溶液： 丙烯酰胺29.2g， 甲叉双丙烯酰胺0.8g， 加水至100ml，棕色瓶4℃保存。

  10. 3．1.5mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液 pH8.8（4x）： 取18.15g Tris， 用1MHCl调pH至 8.8，加水至100ml，4℃保存4．0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲 液，pH6.8（4x）： 取5.98g Tris，用1N HCl调至pH 6.8，加水至100ml，4℃保存。

  11. 5．电极缓冲液（pH8.3）： 取 14.49g甘氨酸，3.02g Tris，加100ml 10%SDS，加水至1 升，4℃保存。6．10% SDS： 取10g SDS，加水至100ml， 完全溶解后室温保存。7．10%过硫酸铵溶液（AP）： 临用前现配。

  12. 8．染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸）： 考马斯亮蓝R-250 2.5g、 甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000ml。9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）： 甲醇（可用无水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml， 补足水至1000ml。

  13. 10．样品缓冲液（2x）：H2O 2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS 3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。11．TEMED（四甲基乙二胺）

  14. 操作步骤1．安装制胶模具A 、要用琼脂进行封边，防止 凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。B、安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。

  15. 2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。

  16. 分离胶的配制

  17. 将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。

  18. 灌胶时要注意： • 催化剂不能加多了，加完催化剂要充分混匀，且立即灌胶， • 灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶聚合。 • 灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。

  19. 3．浓缩胶的制备按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子，将凝胶垂直放于室温下聚合。3．浓缩胶的制备按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子，将凝胶垂直放于室温下聚合。

  20. 浓缩胶的配制

  21. 4．样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1～2分钟。5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上，上下槽各加入电极缓冲液。6．加样： 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。

  22. 7．电泳： 在30mA的电流压下电泳，当样品全部进入分离胶时，加大电流至60mA，当溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。

  23. 8．染色：从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻板取出凝胶，放入染色液中60度水染色30min。8．染色：从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻板取出凝胶，放入染色液中60度水染色30min。

  24. 9．脱色： 移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。

  25. 10、观察电泳结果 • 根据标准样品， 大致推测蛋白质的分子量

More Related