Sécrétion

1. Sécrétion desfacteurs devirulence chez lesbactéries GRAMnégativessophiebleves, romévoulhouxnawel ADJEROUD

2. Sécrétion Excrétion Elimination de Déchets Protéines Enzymes Toxines Survie et Adaptation

3. M.Externe Extérieure Processus Complexe Nécessite six systèmes de sécrétion Périplasme M. Interne Cytoplasme

4. Type VI

6. Vibrio cholerae • Vibrio choleraebactérie à gram négatif • (bacille virgule en français) • Forme: bâtonnet incurvé, mobile • responsable du choléra chez l‘homme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).

7. Sécrétion membranaire de toxine AB5 S/unitéA Système de sécrétion type 2 S/unité B5

8. Type II secretion system of V. cholerae:.ATPase: EpsE . Plateforme MI: EpsE, L, F, M . EpsD Sécrétion Exportation PetidaseEpsO Pseudopilins Pseudopilus (assemblageG)

9. Homologie T2SS-T4SS Pseudopilus Pilus Pseudopilins Pilins TYPE II TYPE IV

10. Bibliographie: Rôle de EpsG Surexpression G Constants ++++ + ApparitionPseudopilus à la surface eps Operon eps G All epsgenes [EpsG] ATPase: EpsE ProteinesPlatforme MI

11. The Question is Comment?EpsG---EpsE EpsL Lien possible Lien Direct/Indirect ??? G G G

12. Pourquoi L: Linker ? Bibliographie: • Mutation en Esupprime mutation en G • Etude structuraleE: a un site d’interactionavec L: E interagit avec G via L G-L L ? Lien E-G E G

13. Méthodologie Pour déterminer interaction EpsG-EpsL: 1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking 2- Co-immunprécipitation

14. 1.Pontage chimique (DSP) • Molécules en interaction « faible » (difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...), • Ou simplement à proximité l’une de l’autre • Figer / immobiliser • ces molécules Pontagecovalent entre les 2 molécules • Agents de pontage • DSP, • imidoester bifonctionnel, glutaraldéhyde, formaldéhyde.

15. Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant • Principe:N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires. DSP+Pro1 Liaisons amides covalentes DSP-Pro1 Libération NH-ester DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product +Pro2 Pro1-DSP-Pro2 Libération NH-ester Réaction avec amine primaire

16. DSP 1 2 EpsL EpsG

17. 2. Co-immunoprécipitation • Technique d’identification des interactions protéine-protéine: • Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!

18. EpsG EpsL SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine

19. RESULTATS

20. Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG Sans EpsGou L Absence G-L:Il existebieninteractionEpsL -- EpsG 60kDa 35kDa DimèreEpsG 15Kda

21. Contrôle: Mesure activité Protéase Mutations epsL et epsG pas de sécrétion de protéase: complexe G-L nécessaire sécrétion Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu

22. Confirmation Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG Délétiond’epsGouepsL Absence du complexeEpsL-EpsG

23. Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG Lanes 4, 6 Augmentation EpsG et complexe G-L Lanes 7, 9 Apparition EpsG-EpsL??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

24. 2. Immunoblott pour EpsG

25. 3. Immunoblott pour EpsL Lanes 7, 9 Augmentation EpsL et complexe G-L Lanes 4, 6 Apparition EpsG-EpsL??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

26. 4. Immunoblott pour EpsL

27. 1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG Mutation pilD Pas de complexe G-L EpsG non clivée de PM élevé Clivage PilD Nécessaire au G-L

28. 2-Clivage par PilD: sur Mutant G Dans pEpsGG-1V Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion Clivage EpsG par PilD est nécessaire au cross-link avec EpsL

29. Lien direct/indirect1. Rôle des autres membres T2S….??? Seule EpsL est essentielle à la formation G-L EpsLEpsG Interagissent Directement

30. 2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….???Immunoblott pour G G-L formé En présence de EpsGEpsL E. coli Aucune protéine de V.choleraeest impliquée G se lie de préférence à L qd L estprésent

31. 3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….???Immunoblott pour L Association EpsG-EpsL spécifique

32. Effet Mutation T112, D91 de EpsG…??? Liaisons H Asp91-Thr112 G devient moins stable

33. Substitutions T112 D91de EpsGWT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG Absence G-L si résidus G substitués (D91E, T112L) Pas de Sécrétionsi Résidussubstitués: domainesconservés Chez ts homologues

34. Conclusion

35. Apport de l’article…? EpsL: Scaffold transduction de signaux entre E-G ‘‘Linker’’ de l’ATPase:EpsE-EpsG: conversion énergie Etude interactions EpsG-EpsL cross-link (1pseudopilin Majeur-le reste duT2SS) L’hydrolyse ATP: Changement dynamique de E Quiaffecte L Qui permetassemblage de G L’associationEpsL-EpsGestspécifique: sans aucunautrecomposé T2SS. EpsGclivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL. Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins InteractionsEpsE-EpsL

36. Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP) Sécrétion ATP ADP +Pi T EpsD OM Pseudopilus Exportation de toxine Clivage PilD C filaments en Hélice M EpsL Peptidase PilD G G G Sec IM EpsF EpsE G T G G T G T G G The conversion of chemical energy to mechanical work: Polymérisation des G Pseudopilins G G

37. Sécrétion de toxine chez V. cholerae Piston

39. Futures Etudes.…? • Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et EpsL. • Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils ‘‘recrutés’’ euxaussi par EpsLpar hydrolysed’ATP? Pour être incorporerdans le pseudopilus. • Comprendreréelementl’implication des interactions EpsG-EpsL (hydrolysed’ATP et ???)

40. Des questions???....Des commentaires???.... De votre attention