I.TANIM Enzimler , metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran, biyolojik katalizörlerdir.

1. E N Z İ M L E RProf.Dr.Emel ULAKOĞLU ZENGİN Prof.Dr.M.Koray GÜMÜŞTAŞİ.Ü.Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı

2. I.TANIM Enzimler, metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran, biyolojik katalizörlerdir. • Protein yapısında maddelerdir. • Hücrenin gereksinimine uygun kataliz yaparlar. • Hücre içindeki yerleşimleri metabolik olayların özelliğine göre düzenlenmiştir.

3. II.ENZİMLERİN TIPTA KULLANIMI 1.Enzim aktivitelerinin ölçümü hastalıkların tanı ve izlenmesinde kullanılır. Örn:Miyokardİnfarktüsünde: CPK (Kreatinfosfokinaz) SGOT (AST) (Serum glutamatoksaloasetattransaminaz) LDH (Laktatdehidrogenaz) 2.Kalıtsal metabolik hastalıklar bazı enzimlerin incelenmesiyle ortaya çıkar. Örn:Galaktozemide: Galaktoz-1-fosfat uridiltransferaz 3.Tedavi amacıyla bazı enzim preparatlarından yararlanılabilinir. Örn: Streptokinaz,Ürokinaz

4. III.ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ Etkiledikleri maddelerin (substratlarının) sonuna -az- takısı eklenerek isimlendirilir. Madde Hidroliz Enzimi Nişasta(Amilon) Amilaz Yağ (Lipos) Lipaz Protein Proteaz Üre Üreaz Bu kurala uymayanlar: Pepsin, tripsin, pityalin Katalizledikleri reaksiyon tipine göre: Oksidaz, dekarboksilaz

5. Günümüzde bu tür karışıklıkları önlemek amacıyla Uluslararası Biyokimya Birliğinin (IUB) Enzim Komisyonu tarafından Sistematik isimlendirme önerilmiştir. Bu sistemde her enzim, katalizlediği reaksiyon tipine ve mekanizmasına göre isimlendirilmektedir. Günlük kullanımda önerilen kısa isme ilaveten daha detaylı sistematik ismin kullanılması öngörülmüştür. SİSTEMATİK İSİMLENDİRMENİN TEMEL ÖZELLİKLERİ 1. Reaksiyonlar ve bu reaksiyonları katalizleyen enzimler, reaksiyon mekanizmalarına göre 6 sınıfa bölünürler. Bu sınıflarında alt sınıfları vardır. 2. Her enzimin bir kod numarası vardır (EC). Bu kod, dörtlü sayı grubu ile gösterilir.

8. Hekzokinaz Sistematik İsimlendirme: ATP + D-Glukoz ADP + D-Glukoz-6-Fosfat Önerilen kısa isim: Hekzokinaz Enzim kodu : EC (2.7.1.1) Sistematik isim : ATP: glukoz fosfotransferaz EC (2.7.1.1): İlk sayı: Reaksiyon tipini açıklar (Major sınıf) Transferaz sınıfı İkinci sayı: Alt sınıf Fosfotransferaz Üçüncü sayı:Alt alt sınıf Hidroksil grubunun alıcı olduğu fosfotransferaz Dördüncü sayı:Enzim için spesifiktir. Fosfat grubunun D-glukoza aktarıldığını açıklar. Enzimin listeye girdiği seri numarasıdır.

9. IV.ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİ 1. Enzimler protein yapısında maddelerdir: • Protein yapısına istisna olarak bazı RNA tipleri gösterilebilir. • Bunlar, fosfodiester bağlarının yıkımı ve sentezi esnasında enzim gibi davranabilirler. Katalitik etkiye sahip RNA’yaRibozimdenir. • 2.Enzimler özgül moleküllerdir. • Enzimler yalnız belirli reaksiyonları katalizledikleri ve ortamdaki moleküllerden sadece • substratları ile etkileştiklerinden dolayı spesifik (özgül)moleküllerdir. • 3.Enzimler katalitik etkinliğe sahiptir. • Enzimle katalizlenen reaksiyonların çoğu katalizlenmeyen reaksiyonlara göre 103 –108 kere daha hızlı olarak gerçekleşmektedir. • Bir enzim molekülü saniyede ortalama 100-1000 substrat molekülünün ürüne dönüşümünü sağlamaktadır. 4. Enzimler görev yerlerine göre kompartmanlanmıştır. Her enzim farklı orgenelde görev alabilir.

11. Karbonik anhidraz Enzimin dönüşüm sayısı (Turnover sayısı): Enzim molekülü tarafından bir saniyede ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır. CO2 + H2O H2CO3 Karbonik anhidraz, 1 saniyede 105 molekül CO2’e, H2O’yu bağlayarak karbonik asid oluşturur. 4.Substrat-ürün dönüşümleri çift yönlü olabilmektedir. C H O Trioz fosfat izomeraz CH2OH O C H OH C CH2OPO3-2 CH2OPO3-2 Dihidroksi aseton fosfat (DHAP) Gliseraldehid-3-fosfat (G3P)

12. Bu iki madde arasındaki izomerizasyon glikoliz yolunda rastlanır. Enzim iki yöne doğru reaksiyon hızını arttırmaktadır. 5.Enzim moleküllerinde aktif bölge ismi verilen özel bir boşluk ya da cep kısmı bulunur. • Aktif bölgedeki aminoasidlerin yan zincirleri, substratın yapısına uyumlu, üç boyutlu bir yapı oluşturmaktadır. Enzim-Substrat kompleksi Substrat Enzim Aktif bölge

13. Aktif bölgenin substratı bağlamasıyla oluşan enzim-substrat kompleksi (ES), önce enzim-ürün kompleksine, daha sonra ise serbest enzim ve ürüne dönüşmektedir. E + S ES EÜ E + Ü • Enzim ile substrat biribirlerine hidrojen, elektrostatikve Van der Waals bağları gibi non kovalent (zayıf) bağlarla bağlanır. • Zayıf bağlar ve bazı kuvvetli bağlar, aktif bölgelerin aminoasidlerini biribirlerine yanaştırmada önemli rol oynarlar.

14. S Aktif Bölge Birçok enzimin katalitik bölgesinde aşağıdaki aminoasidler yer alır: Serin, sistein, histidin, tirozin ve lizin S Bağlanma bölgesi Katalitik bölge S S Katalitik bölge 119 His His S 12 S S S Bağlanma bölgesi RİBONÜKLEAZ

15. Enzimler kolaylıkla denatürasyona uğrarlar: • Denatürasyon,proteinlerin doğal yapılarının bozulması sonucunda • aktivitelerinin kaybolmasıdır. Enzim denatüre olduğunda aktif bölgesi de denatürasyona uğrayarak substratını bağlayamaz, bundan dolayı da etkili olamaz. Başlıca denatürasyona yol açan faktörler: • Isı • Işınlar (X ışınları, UV ışınları, vs) • Çalkalama • Dondurup eritme • Derişik asid ve baz • Alkol, eter, benzen, vs gibi organik çözücüler • Üre, guanidin çözeltileri

16. RİBONÜKLEAZ: • Bu enzim RNA molekülündeki nukleotidleri hidroliz yapar. • Yapısı 4 disülfür bağı ile sağlamlaşmıştır. • Katalitik bölgede 2 histidin kalıntısı yer alır. Histidin 12 ve Histidin 119 • His 12, ribozun hidroksil grubu üzerine etki eder. • His 119, ise fosforil kısmına etkilidir. • Böylece molekülün 2 kısmından kırılma gerçekleşir. • Molekülün taranmış kısmı ise 5 aminoasidin yer aldığı bazik bir bölgedir. • Bu bölge RNA‘yı bağlar.

17. Enzimlerin substrat bağlama yeri olan aktif bölgedeki aminoasidler, substratın ürüne dönüşmesini sağlayan pek çok kimyasal mekanizmayı kullanır. • Bu aminoasidlerden bazıları substratın aktif merkeze bağlanmasını, bazıları ise kataliz olayını sağlamaktadır. • Aktif merkezde yer alan iki bölgeden birincisi bağlanma bölgesi, diğeri ise katalitik bölgeyi oluşturur.

18. Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri sürülmektedir. 1.Model: Anahtar-kilit modeli 2.Model: Katalitik bölgenin “uyum oluşturma modeli”

19. 1.MODEL: • Kilit anahtara olan benzerliğe dayanılmıştır. • Bu modelde enzimin aktif merkezindeki bir bölge ile substrat yapılarının biribirini tamamlayıcı olmaları gerekmektedir. a c b Substrat + a c b ES kompleksi c a b Enzim Kilit-anahtar modeli

20. 2. MODEL: • Katalitik bölgenin “Uyum-oluşturma” modelidir. • Başlangıçta enzim ve substrat biribirlerine uygun değildirler. • Ancak substrat enzimin aktif bölgesine yaklaştıkça, enzim buna uymaktadır. • Substrat, enzimde biçimsel değişiklik meydana getirir. Substrat a c b + a c b a c b ES kompleksi Enzim

21. 6.Bazı enzimler, enzimatik reaksiyon için gerekli olan bir non-protein kofaktör ile birleşirler. • Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn2+,Fe2+,Cu2+, Mn+2 …vs) ve koenzim olarak adlandırılan bir organik molekül, genellikle vitamin türevleri (NAD+, FAD,CoA..gibi) yer alır. • Koenzimlerin pek çoğu genellikle B grubu vitaminlerden türevlenmektedir. • Kofaktörle birleşik durumda olan ve katalitik aktivite gösteren enzimholoenzim olarak bilinmektedir. • Holoenzimin protein kısmına apoenzimadı verilir. • Apoenzim kofaktörün yokluğunda biyolojik aktivite gösteremez. • Protein kısmına sıkıca bağlı olan koenzime prostetik grup denir.

22. Kofaktörü metal iyonu olan bazı metalloenzimler: Kofaktör Enzim Fe2+ Katalaz, peroksidaz Cu2+ Sitokrom oksidaz, tirozinaz Mg2+ Fosfohidrolaz, fosfotransferaz Mn2+ Arginaz Zn2+ Alkol dehidrogenaz Mo2+ Ksantin oksidaz

23. Metal iyonları substrat bağlanmasını ve katalizi kolaylaştırır. • Aşağıdaki 4 form da, metal iyonları ile katalizlenen enzimatik reaksiyonlar için geçerlidir. Enz S M M Enz S Enz M S Enz Substrat-köprü kompleksi Enzim-köprü kompleksi M S Metal-köprü kompleksi Siklik metal-köprü kompleksi

24. KOENZİMİ VİTAMİN OLAN BAZI ENZİMLER: Enzim Vitamin Koenzim Katalizlenen reaksiyon Dekarboksilaz B1 vitamini TPP (Tiamin pirofosfat) ………………...R-CO-COOH (Tiamin) RCHO + CO2 (Dekarboksilasyon) Dehidrogenaz B2 vitamini FMN(Flavin mononukleotid ve…………..Hidrojen (Riboflavin) FAD Flavin adenin dinükleotid) transferi Transaminaz B6 vitamini Pridoksal fosfat ……………….Amino asidlerden aldığı (Pridoksal) -NH2 grubunu α-keto asidlere transfer eder. Karboksilaz Biotin Biotin …………………………α-keto asidlere CO2 ‘i bağlar(Karboksilasyon) Transformilaz Folik asid THF…………………………… -CHO, -CH2 OH, -CH3 (Tetrahidrofolat) gruplarının transferi Transmetilaz B12 vitamini Kobamid…………………………-CH3 grubu transferi İzomeraz koenzim

25. 7. Enzimler hücrenin metabolik gereksinimlerine uygun şekilde aktive veya inhibe edilerek ürün oluşum hızı kontrol edilebilir. Bu olaya enzim aktivitesinin düzenlenmesi denir. 8.Enzimler enerji türlerini biribirine dönüştürürler. • Mitokondrideki küçük moleküller içinde bulunan serbest enerji, ATP enerjisi şekline dönüşür. • Kasta ise ATP enerjisi, kasılma esnasında mekanik enerjiye dönüşür. 9.Enzimler tranzisyon (geçiş) durumunu stabilize ederek reaksiyonları hızlandırırlar. • Moleküllerin reaksiyona girebilmeleri için enerji tüketilmektedir. • Substrat ürüne dönüşürken tranzisyon (geçiş) durumundan geçer. S T* Ü

26. Tranzisyon durumu, S ve Ü’nün serbest enerjisinden çok daha yüksek enerjiye sahiptir. • Reaksiyon tranzisyon durumundan itibaren başlar. • Enerji düzeyinin tepe noktasında bulunan yüksek enerjili geçiş ürünleri daha sonra son ürüne dönüşmektedir. • Enzimlerin yokluğunda, tranzisyon durumuna ulaşabilen çok az sayıda molekül, ürüne dönüşebilmektedir. • Reaksiyon hızı ise, bu yüksek enerjiye sahip moleküllerin sayısı tarafından belirlenmektedir.

27. T* Ea = Aktivasyon enerjisi Ea1 = Enzimle katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi Ea2 = Enzimle katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi Ea1 Ea Ea2 S Serbest enerji Başlangıç durumu ∆G Ortama salınan serbest enerji Ü Bitiş durumu (ürünler) Reaksiyon akış yönü

29. Bir kimyasal reaksiyon ortama enerji salıyor ise, tranzisyon durumuna geçebilmesi için, önce aktivasyon enerjisinden enerji borç alır, sonra bu enerjiyi sarfeder. • Sarfedilen enerjiden geri kalanı ise ortama serbest enerji şeklinde salınır. Ea= Tranzisyon durumu serbest enerjisi – substrat serbest enerjisi • Aktivasyon enerjisi düşük olan reaksiyonların hızı yüksek olmaktadır.

31. “ Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda, enzimler aktivasyon enerjisini azaltarak reaksiyonları hızlandırırlar. Böylece enzim ve substratı, tranzisyon enerjisi daha düşük olan yeni bir reaksiyon yolu oluşturur.” • Spontan reaksiyon • Kimyasal katalizör varlığındaki reaksiyon • Spesifik enzim Tranzisyon durumu Ea Başlangıç durumu ∆G kalori Bitiş durumu

32. V.ENZİMLERİN KATALİZ HIZINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER Kataliz Hızı,birim zamanda oluşan ürün ya da kaybolan substrat miktarıdır. Enzimle katalizlenen reaksiyonların hızını etkileyen faktörler: 1.Enzim Konsantrasyonu 2.Substrat Konsantrasyonu 3.Sıcaklık 4.pH

33. 1.ENZİM KONSANTRASYONU • Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda substrat konsantrasyonu yüksek miktarlarda ise, reaksiyonun başlangıç hızı (Vİ),enzim konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak artmaktadır. Reaksiyon hızı Vİ Enzim konsantrasyonu

34. 2.SUBSTRAT KONSANTRASYONU • Enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızı (V), ortamda enzim konsantrasyonunun sabit olması koşuluyla, substrat konsantrasyonu ile [S] birlikte hızla artar ve maksimal hız (Vmax) değerine varıncaya kadar artış devam eder. • Ancak Vmax’ta substrat konsantrasyonu ne kadar artarsa artsın, kataliz hızı artmaz. • Yüksek substrat konsantrasyonlarında reaksiyon hızının yavaşlaması, enzim üzerindeki substrat bağlama bölgelerinin doygunluğa ulaşmasını göstermektedir. VMAX V [S] VO

35. Enzimlerin çoğu Michaelis-Menten Kinetiği gösterirler. • Belli sıcaklıkta ve sabit enzim konsantrasyonunda, bu kinetiğe uyan enzimler, değişen substrat konsantrasyonu ile başlangıç hızı (VO) arasında hiperbolikbir eğri çizerler (A). • Buna karşılık allosterik enzimlerde, bu eğrisigmoidalözellik taşımaktadır (B). VMAX A B VO [S]

36. 3.SICAKLIK • Kimyasal reaksiyonlarda ısının artması moleküllerin hareketini arttırarak reaksiyon hızının da artmasına yol açar. • Reaksiyon hızının sıcaklık ile artışı, belli bir enerji düzeyini aşabilecek molekül sayısı ile ilgilidir. • Bu durum, enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar için de geçerlidir. “Enzimle katalizlenen bir reaksiyonda sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını arttırmaktadır.” Ancak enzimler protein yapısında maddeler olduklarından, belirli bir ısı derecesinden itibaren (genelde 45ºC) enzimin denatürasyonu söz konusu olacağından, reaksiyon hızında da bir azalma meydana gelecektir.

37. Optimum Temperatür: • Enzimin en iyi etkilediği ısı derecesidir. • Bu ısı derecesi, reaksiyon hızını maksimal arttırırken, daha ilerisinde enzimin denatürasyonuna yol açar. “Enzim etkinliği düşük ısıda az, tepe noktasında en fazla, sıcaklık arttığında ise hızla düşer.” Genellikle, başlangıçta sıcaklığın her 10 ºCartışı, reaksiyon hızının iki katına çıkmasını sağlamaktadır.

38. 100 denatüre olmamış protein yüzdesi reaksiyon hızı (v) 50 O O 40 20 30 50 60 sıcaklık (ºC)

39. Enzim aktivitesinde,optimum temperatür 2 faktörle belirlenmektedir (Kırmızı eğri). • Reaksiyon hızı, gerek spontan gerekse katalizör varlığında, sürekli olarak artar (mavi eğri). • Belirli bir ısı derecesinden sonra, enzim proteini denatüre olur (siyah eğri).

40. Termik İnaktivasyon: Enzim çözeltisi hazırlandıktan sonra enzim aktivitesi ölçülür (Eo). Daha sonra çözelti termostata konarak her 2-3 dakikada bir ısı derecesi arttırılır ve çözeltiden bir kısım alınarak aktivite ölçülür (E). Isıtma süresi arttıkça aktivitede giderek azalma gözlenir. İnaktivasyon, zamanın logaritmik fonksiyonudur. E Eo 30ºC Log 45ºC 55ºC 60ºC zaman(dak)

41. 4.pH Enzimatik reaksiyonlar ortamın H+ iyonu konsantrasyonundan kolaylıkla etkilenirler. • Enzim etkinliğinin en yüksek olduğu pH ,optimum pH’dır. • Her enzimin etki ettiği pHfarklıdır. b a enzimatik aktivite pH 4 8 5 6 7 9 10

42. Enzimler pH değişikliklerine bağlı olarak başlıca 2 tip aktivite eğrisi gösterirler: a) Dar sınırlar içinde etkiyi gösteren çan eğri b)Geniş sınırlar içinde etkiyi gösteren plato eğri Çoğunlukla enzimlerin optimum pH’ı 5-8 arasında değişmektedir. Maksimum aktiviteyi pH= 2’de gösterir. Nötral pH’da çalışan enzimler asidik ortamda denatüre olurlar. Optimum etki Optimum etki Enzimatik aktivite pH 2 pH 6 12 3 5 4 8 10 4 6 7 TRİPSİN Alkali ortamda en iyi etkiyi gösterir. PEPSİN

43. pH değişikliklerinin enzimatik aktivite üzerindeki etkileri aşağıdaki faktörler tarafından belirlenmektedir. 1. Ortamın çok yüksek ve çok düşük pH düzeyleri, enzimin denatürasyonuna yol açarak, yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler yapar. 2. Apoenzim ile koenzim arasındaki bağlar etkilenir. 3. Bir protein olan enzimin yapısındaki amino ve karboksil gruplarının iyonizasyon durumu, ortamın pH değerine bağlı olarak değişir. Aktif bölgedeki iyonizasyon değişikleri, enzim-substrat reaksiyonunu ve buna bağlı olarak katalizi bozar.

44. Örnek: Katalitik aktivite için ortamdan H+ iyonu kazanılması gerekiyor ise, moleküldeki amino gruplarının protonlaşması gibi: - NH2 -NH3+ Alkali pH ‘da proton kaybı olacağından, verilen örnekte enzimatik aktivite hızı düşer. 4. Büyük çoğunlukla pH değişikliklerinden substratın da iyonizasyon durumu etkilenir. H+

45. VI.ENZİM KİNETİĞİ Reaksiyon Hızı (v): Enzim etkisiyle birim zamanda kaybolan substrat miktarı veya oluşan ürün miktarı ile ölçülür. Enzim Moleküler Aktivitesi: Optimum reaksiyon şartlarında, 1 molekül enzim tarafından 1 dakikada ürüne dönüşen substrat miktarıdır. Spesifik Enzim Aktivitesi: mg protein başına düşen enzim ünite sayısıdır. Enzim Ünitesi: Optimal şartlarda, 1 dakikada 1 mikromol (μmol) substratı ürüne dönüştüren enzim miktarıdır.

46. Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlarda genel kimyasal reaksiyon kinetikleri geçerlidir. Michaelis ve Menten isimli araştırmacılar, enzimlerle gerçekleşen reaksiyonlar için basit bir tanımlama yapmışlardır. Enzim kinetiklerinin kantitatif analizleri için geliştirilen bu model, tek substratlı reaksiyonlar için geçerlidir. E + S ES E + Ü k1, k2 ve k3 : reaksiyonların hız sabitleri k1 k3 k2

47. Tersinir olarak sabit bir hızla (k1)substratla [S] birleşen enzim [E], önce enzim-substrat [ES] kompleksini oluşturur. [ES] kompleksi daha sonra başlıca 2 akıbete uğrayabilir: 1. Sabit bir hızla (k2) yeniden E ve S’a dönüşür. 2. Yahut k3 sabit hızıyla ürün [Ü]oluşurken enzim de serbestleşerek ilk yapısını kazanır. ES oluşum hızı =k1[E][S] ES yıkılım hızı = (k2 +k3) [ES]

48. Reaksiyon hızı ile substrat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan Michaelis-Menten denklemi kurulurken aşağıdaki varsayımlar gözönüne alınmıştır: 1. Substrat konsantrasyonu [S], enzim konsantrasyonun [E]’dan çok daha fazladır. Böylece belirli bir zamanda enzime bağlı olan substrat miktarı ihmal edilebilir. 2. Reaksiyonun denge durumunda ES kompleksinin oluşumve yıkılım hızları biribirine eşittir.

49. Reaksiyonun denge durumunda : k1 [E][S] = [k2 + k3][ES](1) [ES] = (2) [E][S] k2 + k3 k1 k2 + k3 Km k1

50. V Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir. VMAX Reaksiyon hızı VMAX 2 [S](mol/L) 0 Km