Universidad Autónoma

1. Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas Biología Molecular Temas: 7.9 Hibridacion de sondas tipo Southern 7.10 Hibridacion de sondas tipo Northern Alumno: José Ulises Montes Amparán.

2. Resultado de Aprendizaje • Comprender los conceptos y principios básicos de la hibridación de ácidos nucleicos. • Explicar los procedimientos de la hibridación tipo Souther para la identificación de genes y genomas, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas. • Explicar los procedimientos de la hibridación tipo Northem para analizar la expresión de genes, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas.

3. Errores mas Frecuentes • Considerar que las técnicas se basan en metodologías inflexibles, siendo que éstas son adaptadas a la muestra que es analizada y a las posibilidades de quien las practica. • No comprender la naturaleza y propiedades de los ácidos nucleicos. • No comprender los fundamentos de la hibridación. molecular. • No tener clara la diferencia entre métodos de marcaje y pensar que sólo un tipo de técnica es útil para un propósito particular.

4. Definición de Términos • Hibridización: Formación de dúplex a partir de cualquier combinación de ácidos nucleicos. • Estringencia: Son las condiciones a las cuales se desarrolla la hibridización y la detección del duplex. • Baja estringencia: Permite mayor cantidad de hibridación pero con menor especificidad (baja temperatura, alta concentración de sales). • Alta estringencia: Menor cantidad de hibridación pero mayor especificidad.

5. Definición de Términos • Copia única: Secuencia de DNA que se encuentra una sola vez por genoma. • DNA repetido: Secuencias presentes en más de una copia. • Dúplex: Estructura de ácidos nucleicos de doble cadena. • Desnaturalización: Proceso por el cual se generan cadenas sencillas a partir de un dúplex. • Reasociación/Renaturalización: Unión de dos secuencias complementarias por medio de apareamiento de bases.

6. Factores que afectan la Hibridación • Temperatura. • La concentración de sales. • Bases no complementarias. • Longitud del fragmento. “Es importante tomar en cuente estos factores ya que las condiciones optimas no son las mismas para cada experimento.”

7. ¿Que es una sonda? • Son oligonucleótidos sintéticos, cDNA, fragmentos de DNA genómico o RNA de cadena sencilla complementarias a la región de DNA o RNA blanco. • Contienen alguna “marca” que revela su unión (hibridación) a la secuencia elegida, generalmente se trata de P32. Sondas Marcadas

8. Hibridación tipo Southern • El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern en 1975 para la detección de genes específicos en el ADN celular. Procedimiento • El DNA del gel se fragmenta con HCl y se desnaturaliza con NaOH. • Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. . • El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. • Las bandas de DNA se visualizan por tinción y se toma fotografía.

9. Procedimiento • A continuación el filtro se incuba con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). • La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

11. Aplicaciones • Caracterizar la identidad de genes específicos. • Identificar fragmentos de DNA que contienen un gen determinado, entre una mezcla de muchos fragmentos. • Investigar la organización molecular de las secuencias genómicas. • Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas humanas y a cáncer. • Detección de restriction site polymorphism (RSP). • Detección de mutaciones puntuales mediante RFLP

12. Hibridación tipo Northern • El método, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar ARN a diferencia de l metodo Southern que se utoliza para identificar ADN. • Las moléculas de RNA son separadas por electroforesis en geles desnaturalizantes. • Las bandas de RNA y marcadores de peso molecular se visualizan por tinción y se toma fotografía. • Los bandas del gel se transfieren a membranas de nylon. • La membrana se seca y se fija. • Se aplica la sonda previamente marcada. • Se permite la hibridización a diferentes condiciones de estringencia en buffer desnaturalizante. Procedimiento

13. Detecta la presencia de RNA de uno o varios tipos celulares o tejidos, complementario a la sonda.

14. Aplicaciones • Proporciona información de la presencia de un transcrito de RNA complementario a la sonda. • Es posible examinar patrones de expresión génica. • Permite detectar cortes y empalmes del mRNA y múltiples tipos de transcritos provenientes de un solo gen. • Es posible caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado.

15. Bibliografía • Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter. Molecular Biology of the Cell. Cuarta edición. New York. Garland Publishing. 2002. • Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. Molecular Cell Biology. New York. W. H. Freeman & Co. 2000. • Cooper, Geoffrey M. The Cell – A Molecular Approach. Segunda edición. Sunderland (MA). Sinauer Associates, Inc. 2000. • scsie.uv.es/chipsdna/IntroduccionUV-2.pdf • www.gfmer.ch/Educacion_medica_Es/Pdf/Analisis-genetica-molecular.pdf