Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára

1. Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESIOrsolya1, FÖLDESAnna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZÁdám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 , BARABÁSJózsef2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1 1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK Háttér Sjögren szindróma sugárterápia (fej-nyaki tumorok kezelésére) csökkent nyáltermelés hiposzaliváció acinus sejtek pusztulása Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra)Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172 PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra)Szlavik et al. Tissue Eng 2008 14:1915-26 Célkitűzés • humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlítása • optimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásához • transzepitheliális ionáramok vizsgálata • az elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása

2. Módszerek és eredmények 1200 Hepato-STIM 800 MEM 2 nap TEER (Ωcm2) 400 MEM 1. nap MEM 0 nap 0 0 2 4 6 8 days Sejttenyésztés – primer kultúra • gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok” • egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok” Transzpithelialis rezisztencia mérése huSMG Hepato-STIM PTHSG Hepato-STIM 10x 10x huSMG MEM PTHSG MEM Kulcstranszporterek (RT-CR) 10x 10x NBC1 NKCC1 NHE1 ENaC Pozitív kontroll:K:Vese Minta jelölések: Me: membránról izolált Pl: plasztikról izolált Ti: nyálmirigy szövetből izolált Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (Isc) mérésével • Hepato-STIM medium (BD Biosciences) • MEM medium (Sigma) • 10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma) • Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco) • Transwell Clear (Corning Costar) • Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (WorldPrecision Instruments) • Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.) • Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma) • Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL) • RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem) • HEPES-puffer oldat, 100% O2;HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és Cl—mentes oldat • amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma)

3. Eredmények K+ Na+ K+ Na+ - - NKA NKA ADP+P ATP ADP+P ATP + + HCO3- K+ ENaC + - + - + + Na Na BAZOLATERALIS OLDAL bumetanid Na+ Na+ Cl- Na+ HCO3- Na+ K+ Cl- CO2 NBC NKCC1 NHE AE DUCT HCO3- H+ CA II CO2+H2O H++HCO3- Ca2+ H2CO3 cAMP PKA II Cl- Cl- ACINI ? CFTR CaCC ATP karbakol forskolin Na+ Cl- Cl- 10 µM amilorid HCO3- APIKALIS OLDAL Klorid és bikarbonát megvonásának hatása Vektoriális iontranszport aktiválása nem stimulált ATP stimulált szekrécióra PTHSG huSMG PTHSG huSMG PTHSG 8 8 8 * * 6 6 6 * * * ∆Isc (µA/cm2) 4 4 ∆Isc (µA/cm2) Isc (µA/cm2) 4 * * 2 2 2 8 8 11 5 4 4 4 8 5 8 6 0 0 0 *p<0,05 *p<0,05 *p<0,05 vs baseline - - HCO3- + HCO3- + forskolin ATP carbachol Cl- + Cl- + - - Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra Apikálisan adott amilorid hatása ATP stimulált szekrécióra nem stimulált 8 PTHSG PTHSG PTHSG huSMG 8 8 6 6 6 * * ∆Isc (µA/cm2) * 4 Isc (µA/cm2) * * 4 ∆ Isc (µA/cm2) 4 2 2 2 5 5 9 9 9 9 3 8 8 8 3 0 0 0 *p<0,05 *p<0,05 *p<0,05 + + - - + + - + + + + HCO3- HCO3-&Cl- HCO3-&Cl- Bum - + - + Ami - + + Ami - + - +

4. Megbeszélés • Primer sejtkultúra: polarizáltepithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából • Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor • Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában • Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző) • Cl- és HCO3- • Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal • Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző) • Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva: működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas Apikális oldal Transwell Cl-;HCO3ˉ Na+ Bazolaterális oldal Támogatás:TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;