LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA TRABALHOS LABORATORIAIS 2010

1. LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA TRABALHOS LABORATORIAIS 2010

2. TRABALHO 1-Etanol Objectivos: Doseamento do alcool no sangue pelos métodos de: -Widmark -Cromatografia gasosa Organização: 1º-Começar pelo método de Widmark (tempo de espera de 2h) 2º-Fazer padrões para GC e elaborar a curva de calibração Analisar a amostra por GC Não usar o GC sem ter assistido a demonstração prévia Montagem do Método de Widmark : Haste onde se coloca a amostra de sangue Mistura cromossulfúrica (amarela) matrazde Widmark

3. Cuidados a ter no Método de Widmark: Usar luvas Confirmar temperatura do banho (60 ºC) Prender matrazes de Widmark com pinças Colocar as hastes, com restos de sangue, na lexívia Cuidados a ter no Métodoporcromatografiagasosa: A mudança de soluções , quer do padrão, quer das amostras, implica lavagem da seringa. Fazer cálculos da razão: área do padrão/área do padrão interno e representar vs. concentração. Atenção ao volume das tomas de ensaio e diluições nos dois métodos. No Met. de Widmark-> titula-se indirectamente o dicromato remanescente (que não foi reduzido e apresenta cor verde). Após adição de KI (5%) ao k2CrO7, liberta-se I2que será titulado pelo hipossulfito de sádio (Na2S2O3), ficando a solução final incolor, no ponto de equivalência.

4. Fundamentos: 1- Método de Widmark O alcool é separado do sangue por difusão no frasco de Widmark, em banho-maria à temp. de 60ºC/2h, reduzindo o dicromato colocado no matraz. Titula-se indirectamente o dicromato remanescente (que não foi reduzido). Após adição de KI (5%) ao k2CrO7, liberta-se I2que será titulado pelo hipossulfito de sódio (Na2S2O3) N/100, ficando a solução final incolor, no ponto de equivalência.

5. Esmerilado com silicone ou vaselina H2SO4+sangue Cloreto de paládio TRABALHO 2 – Carboxihemoglobina e Metahemoglobina no sangue Objectivos: -Doseamento do monóxido de carbono por redução do cloreto de paládio em célula de Conway (coeficiente de envenenamento) - Doseamento da metahemoglobina no sangue por um método colorimétrico Montagem: Célula de Conway

6. Organização: • - Começar por preparar a célula de Conway com a amostra de sangue em que se pretende determinar o monóxido de carbono e colocar na placa oscilante (+ 2h). • - Fazer os padrões de cloreto de paládio e ler as absorvências • Fazer determinações de metahemoglobina; solução I e II estão preparadas mas é necessário preparar R1 e a sol. de KCN • Cuidados a ter: • - Colocar o sangue na célula de Conway com esta quase fechada e rapidamente para evitar que o CO existente se liberte para a atmosfera. • - Não esquecer de mudar de lâmpada para proceder ao doseamento do cloreto de paládio (=278 nm; UV) e usar só células de quartzo. Especificidades do trabalho: Carboxihemoglobina Reacção de redução do cloreto de paládio Calcular a % de carboxihemoglobina ou coeficiente de envenenamento

7. Metahemoglobina Leitura 1absorvância a 630 nmmetahemoglobinavalor A +Adição de cianeto de potássio Leitura 2cianometahemoglobinavalor B («A) Leitura 3 (após adição de ferricianeto de potássio) hemoglobina+metahemoglobinavalor C + Adição de cianeto de potássio Leitura 4valor D A diferença (A-B) é proporcional à meta-Hb existente na amostra. A diferença (C-D) é proporcional à Hb total. V.N ≤ 2 %

8. TRABALHO 3- Doseamento do ácido δ-aminolevulínico na urina (Pb) e Determinação das coproporfirinas em ratos expostos ao PB PB PB PB PB (Woods, 1995)

9. O Pb interfere na biossíntese do grupo heme: • - Ao nível da actividade de três enzimas; a ALA-D, a ALA-S e a COPRO-D • A inibição da ALA-D resulta na acumulação de δ- ALA no plasma e, consequente excreção na urina • Aumento das coproporfirinas urinárias • Diminuição da hemoglobina • aumento de ferro nos eritrocitos Organização do trabalho: - Não trocar a ordem dos reagentes - Não confundir a fase orgânica com a aquosa Valores normais: δ-ALA- V.N ≤ 2 mg/L Coproporfirinasurinárias- V.N ≤150 µg/L aceitável-150-500 µg/L excesso-500-1500 µg/L perigoso≥ 1500 µg/L

10. Fundamento do Método (ácido δ-aminolevulínico): 1- condensação do ALA + acetoacetato de etilo--ALA-pirrol que se extrai da fase aquosa (+ ureia que reage com o reagente de Ehrlich) com acetato de etilo 2- Adição de reagente de Ehrlich ao ALA-pirrol, na presença de acetato de etilo, formando-se um conjugado com coloração vermelho cereja, com absorvência a 553 nm (adaptado de Tomokuni e Ogata, 1972) ClinicalChem., 18, 1534-1536

11. TRABALHO 4 – Pesquisa de pesticidas Organofosforados na terra e Determinação da actividade colinesterásica no soro ou plasma Montagem: Organização: 1º- Montar o soxlet e iniciar a extracção 2º - Saturar a câmara de cromatografia 3º-Det. Actividade colinesterásica 4º- Concentração do extracto e preparar placa TLC com padrões • Cuidados a ter: • Não respirar padrões de TLC • Det. act. Colinesterásica - O ”kit” é composto por 2 frascos de pó liofilizado que se reconstituem com H2O destilada. • Reunir todo o material necessário para a det. da act. colininesterásica junto ao espectofotómetro, não esquecendo cronómetro. • Agitar a tina (de plástico) após adição da amostra; no final colocar na lexívia. • Especificidades do trabalho: • Organofosforados pesquisados na amostra de terra: Paratião; Malatião e Gusatião

13. Butiriltiocolina + H2O pseudocolinesterase tiocolina + butirato Tiocolina + hexanocianoferrato (III) ditiobiscolina + hexanocianoferrato de potássio (II) Determinação da actividade colinesterásica no soro ou plasma Butiriltiocolina + H2O pseudocolinesterasetiocolina + butirato Tiocolina + ditiobisnitrobenzoato 2-nitro-5-mercaptobenzoato