html5-img
1 / 75

รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

Protein Synthesis : Translation and Posttranslational Modifications. รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557. Protein synthesis. Translation คล้ายคลึงกันทั้งใน prokaryote และ eukaryote สารตั้งต้น คือ กรดอะมิโน 20 ชนิด ชนิดของโปรตีนที่สังเคราะห์ ถูกกำหนดโดย mRNA

zuwena
Télécharger la présentation

รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Protein Synthesis : Translation and Posttranslational Modifications รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

  2. Protein synthesis • Translation • คล้ายคลึงกันทั้งใน prokaryote และ eukaryote • สารตั้งต้น คือ กรดอะมิโน 20 ชนิด • ชนิดของโปรตีนที่สังเคราะห์ ถูกกำหนดโดย mRNA • การสังเคราะห์โปรตีนเริ่มจากจุดเริ่มต้นทางด้าน NH2-terminal ไปสิ้นสุดที่ COOH-terminal • ในมนุษย์สามารถพบการสังเคราะห์โปรตีนได้ทั้งใน cytosol, RER และ mitochondria

  3. ปัจจัยที่ใช้ในการสังเคราะห์โปรตีนปัจจัยที่ใช้ในการสังเคราะห์โปรตีน • L-amino acid • t-RNA • Genetic code • Aminoacyl-tRNA synthetase • ribosome

  4. Amino acid

  5. Transfer RNA (tRNA) • มีประมาณ 50 ชนิด โดยกรดอะมิโนบางชนิดมี tRNA ที่เป็นคู่มากกว่า 1 ชนิด • Clover leaf หรือ L-shape • tRNA จะมีเบส 3 ตัวที่ complementary กับ codon บน mRNA เรียกเบส 3 ตัวนี้ว่า anticodon • Wobble position

  6. Transfer RNA (tRNA)

  7. Wobble position • Wobble position (base) คือ เบสที่อยู่ตำแหน่ง 3’ ของ codon และเบสตำแหน่ง 5’ ของ anticodon ซึ่งโดยทั่วไป การจับคู่กันของเบสคู่นี้อาจไม่เป็นไปตามกฎทั่วไปของการจับคู่ • การมี wobble base ทำให้ tRNA 1 ชนิด จับกับ codon ของ mRNA ได้มากกว่า 1 codon

  8. Genetic code Second position U C A G UUU UAU UGU UCU Tyr Cys Phe UGC U C A G UUC UAC UCC U Ser UUA UCA UAA UGA STOP Leu STOP UCG UUG UAG UGG Trp CUU His First position CAU CAC CCU CCC CCA CCG CGU CGC CGA CGG U C A G CUC Leu C Pro Arg CUA Third position Gln CUG CAA CAG AUU AUC AUA Asn Ser lle ACU ACC ACA ACG AGU AGC U C A G AAU AAC Thr A Lys Met Arg AUG AAA AAG AGA AGG GUU GUA GUG Asp GCU GCC GCA GCG GAU GAC U C A G GUC GGU GGC GGA GGG Gly Ala Val G Glu GAA GAG

  9. Genetic code • รหัสพันธุกรรม • แต่ละรหัสประกอบด้วย nucleotide 3 ตัว เรียงต่อกัน เรียกว่า triplet code หรือ codon • สิ่งมีชีวิตทุกชนิด ทั้ง prokaryote และ eukaryote ใช้ genetic code เดียวกัน (ยกเว้นใน mitochondria ของมนุษย์มีรหัสบางรหัสต่างออกไป) จึงอาจเรียกว่า universal genetic code • Genetic code บน mRNA จะมีแต่ละ codon เรียงต่อกันไป โดยไม่มีการเว้นวรรค (commaless) และไม่ซ้อนกัน (non-overlapping)

  10. Genetic code • รหัสพันธุกรรมมีทั้งหมด 64 รหัส (43 = 64) โดย 61 รหัสจะเป็นรหัสสำหรับกรดอะมิโน 20 ชนิด ที่เหลือ 3 รหัส เป็นรหัสสำหรับหยุดการสังเคราะห์โปรตีน • กรดอะมิโนส่วนใหญ่จะมีรหัสพันธุกรรมมากกว่า 1 รหัส เรียก degenerate • มีกรดอะมิโน 2 ชนิด (methionine และ tryptophan) ที่มีรหัสพันธุกรรมรหัสเดียว • AUG เป็นรหัสพันธุกรรมสำหรับ methionine และเป็นรหัสเริ่มต้นการสังเคราะห์โปรตีน เรียกว่า initiation codon • UAA, UAG และ UGA เป็นรหัสที่หยุดการสังเคราะห์โปรตีน เรียกว่า nonsense (stop) codon

  11. Gene mutation & protein synthesis • Regulatory element mutation : ทำให้การเกิด transcription เปลี่ยนแปลง (เพิ่มขึ้น/ลดลง) ส่งผลให้ปริมาณของโปรตีนเปลี่ยนไป • Structural gene mutation : ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงต่าง ๆ ดังนี้ • Missense mutation • Nonsense mutation • Chain termination (sense) mutation • Splicing mutation • Silent mutation • Frameshift mutation

  12. Structural gene mutation • Missense mutation : โปรตีนมีกรดอะมิโนเปลี่ยนไป CAU (His) CAG (Gln) • Nonsense mutation : โปรตีนสั้นลง (truncated polypeptide chain) CGA (Arg) UGA (stop) • Sense mutation : โปรตีนยาวขึ้น UAA (stop) UAC (Tyr)

  13. Structural gene mutation • Silent mutation AAA (Lys) AAG (Lys) • Frameshift mutation Pro Gln Trp Ser Arg His 3′ Normal 5' C C A C A G U G G A G U C G A C A U U Mutant 5' 3′ C C A C A G U G G A A G U C G A C A U (base insertion ) Pro Gln Trp Lys Ser Thr

  14. Aminoacyl-tRNA synthetase • ทำหน้าที่จับคู่กรดอะมิโนกับ tRNA ที่เป็นคู่กัน (cognate tRNA) เรียกขั้นตอนนี้ว่า activation of amino acid amino acid + ATP + tRNA aminoacyl-tRNA + AMP + PPi PPi 2Pi ขบวนการนี้อาศัย Mg2+เป็น cofactor และต้องการ ATP (2 ATP) • เอนไซม์นี้มี 20 ชนิด แต่ละชนิดจำเพาะกับกรดอะมิโนแต่ละตัว

  15. Aminoacyl-tRNA synthetase • การจับกันของกรดอะมิโนกับ tRNA เกิดจาก α-COOH group ของ กรดอะมิโนกับ 3’-OH group ของ tRNA จับกัน เกิดเป็น high energy ester bond ซึ่งพลังงานของพันธะนี้จะใช้ในการสังเคราะห์ peptide bond ต่อไป • เอนไซม์นี้ยังสามารถ proofreading ตรวจสอบ aa-tRNA ที่เกิดขึ้น โดยถ้า aa-tRNA มีโครงสร้างที่ผิด เอนไซม์จะสลาย aa-tRNA กลับเป็นกรดอะมิโนและ tRNA

  16. Ribosome • ตำแหน่งที่เกิดการสังเคราะห์โปรตีน • ประกอบด้วย 2 subunits (small & large subunit) • large subunit ประกอบด้วย • P site : เป็นบริเวณที่เกิดสาย polypeptide • A site : เป็นบริเวณที่ aa-tRNA มาเกาะ • Prokaryotic ribosome : 70S (50S & 30S) • Eukaryotic ribosome : 80S (60S & 40S)

  17. Process of translation • Initiation • Elongation • Termination

  18. Initiation • การ identify จุดเริ่มต้นของ coding sequence บน mRNA (ซึ่งก็คือ codon AUG ตัวแรกจากด้าน 5’) • ปัจจัยที่ใช้ในขั้นตอน initiation • mRNA • Met-tRNA (ใน prokaryote ใช้ formyl methionyl-tRNA) • ribosome • initiation factors (IF) • GTP • ATP

  19. Process of initiation (eukaryotes) • eIF2a จับกับ GTP และ Met-tRNAiได้เป็น ternary complex • Ribosome แยกเป็น 2 subunit โดย 40S subunit รวมกับ eIF3, ternary complex และ eIF4c ได้เป็น eIF2a.Met-tRNAi.GTP, eIF3.40S, eIF4c complex • complex นี้จะจับ mRNA ทางด้าน 5’ ได้เป็น preinitiation complex ซึ่งต้องอาศัย ATP และ IF ในการอ่านรหัสจากด้าน 5’ ไปด้าน 3’ จนถึง codonAUG ชุดแรก

  20. Process of initiation (eukaryotes) • anticodon ของ tRNA เกิด base pairing กับ AUG ของ mRNA ทำให้ GTP ถูกเปลี่ยนเป็น GDP • IF ต่าง ๆ และ GDP ถูกปล่อยออกมา และ 60S subunit ของ ribosome เข้ามารวม เกิดเป็น initiation complex

  21. Process of initiation (prokaryotes) • มีลำดับของพิวรีนนิวคลีโอไทด์ที่เรียกว่า Shine-Dalgarno sequence อยู่ประมาณ 10 นิวคลีโอไทด์ ทางด้าน upstream ของ AUG • IF ต่าง ๆ น้อยกว่า ใน eukaryote AUG 5' 3' mRNA Prok. Shine-Dalgarno sequence ( 10 nt. upstreamของ AUG ) initiation complex อยู่ที่ P site ของ ribosome

  22. Elongation • เกิดขึ้นหลังการเกิด initiation complex • ribosome จะต่อสาย peptide ให้ยาวขึ้นโดยการอ่าน codon บน mRNA ไปเรื่อย ๆ จนถึง termination codon • ปัจจัยที่ใช้ คือ • initiation complex • aminoacyl-tRNA ที่รวมกับ eEF1αและ GTP เป็น complex • elongation factors (EF) • GTP

  23. Process of elongation • eEF-1αที่จับกับ GTP จะพา aa-tRNA ไปรวมกับ initiation complex ที่ A site • เกิด base pairing ระหว่าง base ของ codon บน mRNA กับ anticodon บน aa-tRNA ทำให้ eEF-1αกับ GTP เปลี่ยนเป็น GDP. eEF-1αต่อมา GDP หลุดออกจาก ribosome ปล่อย aa-tRNA ไว้ที่ A site ของ ribosome • peptidyl transferase ใน ribosome สลาย ester bond ระหว่างกรดอะมิโนกับ tRNA ที่ P site แล้วนำ α-COOH group มาต่อกับ α-NH2 group ของกรดอะมิโนอีกตัวที่ A site

  24. Process of elongation • เกิด translocation ย้าย peptidyl-tRNA จาก A site มาที่ P site โดยอาศัย eEF-2 (translocase) และ GTP • deacylated tRNA จะเคลื่อนที่จาก P site ไป E site • เมื่อ A site ว่าง aa-tRNA ตัวใหม่จะเข้ามาจับ และเกิดขบวนการต่าง ๆ ดังที่กล่าวมาใหม่

  25. Process of elongation

  26. Termination • เกิดเมื่อ ribosome สังเคราะห์ peptide จนมาถึง termination codon (UAA, UAG หรือ UGA) • eRF และ GTP จะจับที่ A site • ปล่อย deacylated tRNA จาก E site • ปล่อย peptide ที่สังเคราะห์ได้ออกจาก ribosome

  27. Process of termination

  28. Energy requirement for protein synthesis • Aminoacylation of tRNA ATP AMP + Ppi • Binding of Met-tRNAi to P site • Aminoacyl-tRNA binding to A site • Translocation • Termination

  29. Polyribosome (polysome) • mRNA สายเดี่ยวแต่มี ribosome เกาะอยู่หลายกลุ่ม • เกิดจากเมื่อ ribosome เริ่มสังเคราะห์โปรตีนไปแล้ว ribosome ตัวใหม่จะเริ่มสังเคราะห์โปรตีนอีกโมเลกุลได้โดยไม่ต้องรอให้ ribosome ตัวแรกสังเคราะห์โปรตีนจนจบสายก่อน • การมี polyribosome ทำให้เซลล์สังเคราะห์โปรตีนได้เร็วขึ้น

  30. Polyribosome

  31. Inhibitors of protein synthesis • affect on prokaryotes : streptomycin, tetracycline, chloramphenicol & erythromycin • affect on eukayotes : cycloheximide & diphtheria toxin • affect both prokaryotes & eukaryotes : puromycin

  32. Inhibitors of protein synthesis

  33. Protein folding Hsp60 • การสังเคราะห์โปรตีน ทำให้เกิด 1° structure ของโปรตีน • สำหรับการเกิด 2° และ 3° structure โปรตีนบางชนิดสามารถเกิดได้เอง (self-assembly) แต่โปรตีนบางชนิดต้องอาศัยโปรตีนชนิดอื่นเป็นตัวช่วย เช่น • molecular chaperone (heat shock protein) ป้องกันการเกิดโครงสร้างที่ไม่ต้องการ และทำให้โปรตีนเสถียร • prolyl isomerase เปลี่ยน cis-trans isomer ของ proline ในโปรตีน binding Cycle repeated many times

  34. Protein folding • mutation บางชนิด ทำให้การเกิด protein folding ผิดปกติไป และทำให้โปรตีนดังกล่าวไม่สามารถถูกส่งออกจาก ER ได้ • ตัวอย่างเช่น mutation ของ α1-antiprotease (ทำหน้าที่เป็น elastase inhibitor) abnormal folding of α1-antiprotease retention of α1-antiprotease within hepatocyte elastase activity ในปอดสูงขึ้น lung destruction

  35. Protein translocation (protein targeting) • การเคลื่อนย้ายโปรตีนจากบริเวณที่สังเคราะห์ไปยังบริเวณที่โปรตีนทำงาน แบ่งได้เป็น 2 กลุ่ม 1. Post-translational translocation 2. Cotranslational translocation

  36. Post-translational translocation • การเคลื่อนย้ายโปรตีนที่เกิดหลังจากการสังเคราะห์โปรตีนเสร็จสิ้น • เกิดที่ free ribosome • พบในการสังเคราะห์โปรตีนเพื่อใช้ใน nucleus, cytosol, mitochondria และ peroxisome

  37. Cotranslational translocation • การเคลื่อนย้ายโปรตีนที่เกิดขณะที่การสังเคราะห์โปรตีนยังไม่สิ้นสุด • พบในการสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นส่วนประกอบของ membrane และ secretory protein เช่น โปรตีนใน ER, Golgi body, lysosome • โปรตีนในกลุ่มนี้จะมี signal sequence ที่ด้าน N-terminus • ขั้นตอนการเกิด cotranslational translocation • Signal sequence จะจับกับ signal recognition particle (SRP) • SRP จะพาโปรตีนและ ribosome ไปจับกับ SRP receptor (docking protein) ที่ ERและโปรตีนจะถูกส่งเข้าไปใน lumen ของ ER • เมื่อสังเคราะห์โปรตีนเสร็จ singal sequence จะถูกตัดออก • โปรตีนใน lumen ถูกส่งไป Golgi body และเกิด exocytosis

  38. Cotranslational translocation

  39. Secretion • เป็นขบวนการส่งโปรตีนที่สังเคราะห์ออกไปใช้นอกเซลล์ แบ่งได้เป็น 2 ประเภท • Constitutive secretion • ตัวอย่างเช่น การส่ง plasma protein ออกนอกเซลล์ • Regulated excretion • โปรตีนที่สังเคราะห์จะถูกเก็บไว้ใน secretory vesicle • เมื่อเซลล์ถูกกระตุ้น โปรตีนจะถูกปล่อยออกมาโดยวิธี exocytosis

  40. Intracellular protein degradation • โดยทั่วไปโปรตีนแต่ละชนิดจะมี half-life ต่างกัน เช่น ในเซลล์ตับ เอนไซม์ที่ควบคุม metabolism จะสลายเร็วกว่าโปรตีนอื่น • โปรตีนที่มี PEST sequence (proline-glutamate-serine-threonine) มากจะมี half-life สั้น

  41. Intracellular protein degradation การสลายโปรตีนในเซลล์ • ATP dependent proteolysis เกิดขึ้นใน proteasomes โดยอาศัยโปรตีน ubiquitin • Lysosome degradation • Other proteolytic systems - Apoptosis หรือที่เรียกว่า programmed cell death อาศัยเอนไซม์ caspases - Calcium-dependent thiol proteases ที่เรียกว่า calpains

  42. Ubiquitin-ATP dependent pathway • ทำหน้าที่สลายโปรตีนที่ผิดปกติ หรือหมดอายุการใช้งาน เช่น regulatory protein และ protein ที่เกี่ยวข้องกับการแบ่งตัวของเซลล์ • ubiquitin จะจับกับ NH3+ group ของ lysine ของโปรตีนต้องการสลาย โดยอาศัย E1, E2และ E3 • จากนั้น protease complex จะสลายโปรตีนและปล่อย ubiquitin ออกไปใช้ได้ใหม่

  43. Ubiquitin-ATP dependent protein degradation

  44. Lysosome degradation เป็นการสลายโปรตีนโดย protease ของ lysosome ที่เรียกว่า cathepsins ซึ่งแบ่งออกตามหน้าที่ได้ดังนี้ • Exocytosis เป็นการส่งเอนไซม์ออกไปสลายโปรตีนนอกเซลล์ • Autophagic เป็นการสลาย organelle ภายในเซลล์ • Phagocytosis เป็นการสลายโปรตีนที่เข้ามาในเซลล์ • Autolysis of cell เป็นการสลายตัวเองของเซลล์

  45. Lysosome degradation

  46. Posttranslational processing • โปรตีนบางชนิดหลังจากสังเคราะห์เสร็จแล้ว จะมีการเปลี่ยนแปลงภายในโมเลกุลของมันก่อน จึงจะทำงานได้ตามปกติ • ขบวนการเปลี่ยนแปลงนี้ ได้แก่ • proteolytic cleavage: การเปลี่ยน zymogen หรือ prohormone ให้เป็น active form • covalent modification : γ-carboxylation, hydroxylation, N-methylation, phosphorylation, acylation และ prenylation

  47. Proteolytic cleavage • การเปลี่ยน zymogen เป็น enzyme ที่ออกฤทธิ์ได้ trypsinogen trypsin factor XII factor XIIa • การเปลี่ยน prohormone เป็น hormone proinsulin insulin pro-opiomelanocortin ACTH + MSH + (POMC) β-endorphin

  48. γ-carboxylation • เกิดที่ glutamate บางตัวของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือด • ปฏิกิริยานี้ต้องอาศัย vitamin K

  49. Hydroxylation • การเติม –OH ที่ side chain ของกรดอะมิโนบางตัว • ตัวอย่างเช่น hydroxylation ของ proline และ lysine ใน collagen โดยเอนไซม์ proline hydroxylase และ lysyl hydroxylase ได้เป็น hydroxyproline และ hydroxylysine ตามลำดับ • ขบวนการนี้จำเป็นต่อการเกิด H-bond ระหว่างสาย collagen • ปฏิกิริยานี้ต้องอาศัย vitamin C

More Related