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尿脱落细胞 hTERT mRNA 表达在膀胱癌早期无创诊断中的价值

尿脱落细胞 hTERT mRNA 表达在膀胱癌早期无创诊断中的价值. The value of the expression of telomerase reverse transcriptase mRNA in diagnosis on bladder cancer. 海军总医院检验科 马学斌. 膀胱癌现状. 发病率在男性泌尿生殖道肿瘤中居前列 50-69 岁发病率最高，约占 58-79% 近 30% 的膀胱癌为多发肿瘤 复发率高，可达 50-70% 复发者通常有 15-25% 进展到高级别，高分期 有逐渐上升的趋势. 研究背景. 膀胱癌的诊断方法 ：.

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尿脱落细胞 hTERT mRNA 表达在膀胱癌早期无创诊断中的价值

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Presentation Transcript

  1. 尿脱落细胞hTERT mRNA表达在膀胱癌早期无创诊断中的价值 The value of the expression of telomerase reverse transcriptase mRNA in diagnosis on bladder cancer 海军总医院检验科 马学斌

  2. 膀胱癌现状 • 发病率在男性泌尿生殖道肿瘤中居前列 • 50-69岁发病率最高，约占58-79% • 近30%的膀胱癌为多发肿瘤 • 复发率高，可达50-70% • 复发者通常有15-25%进展到高级别，高分期 • 有逐渐上升的趋势

  3. 研究背景 • 膀胱癌的诊断方法： 膀胱镜（金标准，有创，敏感性特异性范围：70-80%） 尿细胞学（敏感性低） 膀胱肿瘤标志物（BTA，NMP22，微卫星DNA，端粒酶，hTERT）

  4. 临床需求 • 在过去的数年中，科学家尝试了多种无创诊断方法，但是由于敏感性和特异性不足，或难于应用于常规临床检查，而限制了其在临床上的应用，均没有得到一致的认同。因此，寻找一种新的无创的技术用于膀胱癌的诊断及跟踪尤为必要而迫切。

  5. 端粒酶：在染色体末端添加端粒重复序列，使细胞得以永生化端粒酶：在染色体末端添加端粒重复序列，使细胞得以永生化

  6. 端粒酶的组成： • 端粒酶RNA（hTR） • 端粒酶相关蛋白(hTP1) • 端粒酶逆转录酶（hTERT） • （肿瘤增殖的标志）

  7. 在hTERT的催化作用下，端粒酶以RNA为膜板，合成端粒重复序列。在hTERT的催化作用下，端粒酶以RNA为膜板，合成端粒重复序列。

  8. hTERT应用于膀胱癌诊断的发展 • 组织中表达的检测： • 敏感性和特异性均为100% • ----Clin Cancer Res 1998 Jul;4(7):1603-8 • 尿液脱落细胞中的表达： • 敏感性是80%特异性是95% • ----Clin Cancer Res, 1998, 4(11):2807-2810 • 问题：拷贝数少，不稳定。

  9. 本研究目的及创新点 • 为了进一步探讨尿液中hTERT mRNA表达检测的应用价值，我们在前人研究的基础上采用了巢式RT-PCR的方法以提高检测的敏感性 • 鉴于RNA不稳定容易降解的特点，采用患者早晨的第二次尿液 • 置4℃保存并在1小时之内离心收集脱落细胞沉淀，提取RNA进行检测，

  10. 临床资料 肿瘤组：28例(经临床和病理证实) （男22例，女6例，年龄40-72岁，平均57.5岁。）采用WHO标准及国际抗癌联盟（UICC）TNM系统对肿瘤进行分级 ： G1级12例 G2级9例 G3级6例 非肿瘤组：20例（泌尿系统良性疾病） （男性12例，女性8例，年龄26-79岁，平均年龄55.9岁）

  11. 实验方法 • 膀胱镜检查前留取尿液200ml，4℃保存 • 离心1550rpm，10min • PBS洗2次，细胞记数 • 3000g离心10min，收集细胞 • 总RNA的提取及巢式RT-PCR检测

  12. 总RNA提取及反转录 • 采用Promega公司的总RNA 提取试剂盒，按操作程序提取总RNA： • RNA的A260/A280比值在1.8~2.0，纯度符合实验要求 • RNA电泳检测28S/18S≈2/1，完整性符合实验的要求 • 采用Promega公司的逆转录试剂盒，按其操作程序用随机引物逆转录合成cDNA

  13. 巢式RT-PCR扩增示意图： 上游外引物 上游内引物 hTERT mRNA 145bp 下游内引物 下游外引物 283bp

  14. hTERT mRNA 巢式PCR扩增引物序列 • Outer primer: • Sense: 5’-GTT CCT GCA CTG GCT GAT GAG-3’ Antisense: 5’-GTC CAT GTT CAC AAT CGG CCG-3’ • Inner primer: Sense : 5’-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3’ • Antisense: 5’-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3’

  15. 结 果 • 膀胱癌组：28例，阳性率93%（26/28）对照组：20例，阳性率为10%（2/20） • 敏感性为93% • 特异性为90% • 经统计学处理，膀胱癌组与对照组差异有统计学意义（P<0.01）。

  16. Fig 1 Representative results of nested PCR analysis for expression of hTERT mRNA and GAPDH mRNA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

  17. hTERT mRNA表达与TCC病理分级与分期 • 尿脱落细胞hTERT mRNA阳性率与TCC分级各组间，虽然G1级的阳性率低于G2和G3级，但无显著统计学差异；尽管浸润型阳性率高于浅表型，但无显著统计学差异（P >0.05）

  18. TCC分期与分级 n 阴性 阳性 阳性率（%） 分级 G1 12 1 11 91.7% G2 9 0 9 100% G3 6 0 6 100% 分期 Tis-T1 23 2 21 91.3% T2-T3 5 0 5 100% 表1 尿脱落细胞hTERT mRNA表达率与TCC分级、分期的关系

  19. hTERT mRNA 表达与TCC肿瘤数目及体积大小 • 肿瘤数目小于3个的阳性率低于肿瘤数目大于3个的，但是两者之间没有显著性差异（P >0.05） • 肿瘤体积3cm者阳性率小于肿瘤体积>3cm者，但是两者之间也没有显著性差异（P >0.05）

  20. TCC数目与大小 n 阴性 阳性 阳性率（%） 数目 1-3个 25 2 23 92% 4个 3 0 3 100% 大小 3cm 23 2 21 91.3% >3cm 5 0 5 100% 表2 尿脱落细胞hTERT mRNA表达与TCC数目及体积大小的关系

  21. 讨 论 • 作为一种新的无创的技术应满足以下需求： • 敏感性和特异性至少要达到70% • 应当从分化良好的肿瘤及早期肿瘤中都能检测出来 • 尽可能的方法简便易于掌握，不因检验人员的不同而有很大的差异 • 检测方法应是常规可行的，检测结果具有可重复性 • 检测方法必须是简单，高效，价廉，适用于大量尿样本的大规模分析

  22. 讨 论 • 端粒酶是一种特殊的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，能以自身的RNA为模板合成端粒重复序列（TTAGGG）以补偿细胞分裂时染色体末端（端粒）的缩短 • 端粒酶在正常组织细胞中不表达或呈低水平，而在肿瘤组织细胞和癌细胞株及一部分干细胞中其活性增高，呈高表达状态，被认为是一种特异的肿瘤标记物 • 端粒酶的发现为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了一条新的途径，受到了广泛的关注

  23. 端粒酶活性检测发展 （一） • 1989年Morin等 ：首先检测到了端粒酶活性并创建了测定端粒酶活性的端粒重复序列延伸方法 • 1994年Kim等 ：建立了端粒重复片段扩增（TRAP）法 • 端粒酶活性检测在肿瘤包括泌尿系肿瘤中得到了广泛开展

  24. 端粒酶活性检测发展 （二） • 1997年：hTERT被成功克隆，推动了新一轮诊断方法的发展 • 1998年 ：hTERT用于膀胱癌诊断 • 之后，诊断方法从检测端粒酶活性的TRAP法到检测亚单位表达的RT-PCR法，检测标本从组织到尿液脱落细胞，经历了一个逐步的发展过程

  25. 检测中的技术问题 • 1，细胞数量的多少：在正常人的尿液中脱落细胞数量非常少不足以提取RNA，因而以泌尿系非恶性肿瘤患者为对照 • 2，尿液量的多少：尽管文献中报道的收集尿液量为膀胱癌组50ml，对照组150ml[5]，但我们在研究中发现，这样的尿液量中的脱落细胞数不能够保证，而我们在前期的RNA提取实验研究中认为，成功提取RNA 的最少的细胞数量为105个。因此，我们通过对尿液中的脱落细胞的计数，选定了收集患者及对照的尿液量为200-250ml。

  26. 结 论 • 巢式RT-PCR检测尿液脱落细胞hTERT mRNA的表达是一种敏感性高、特异性好的膀胱癌无创诊断方法，有望用于膀胱癌的筛查及辅助临床诊断。

  27. 谢谢

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