High- P erformance L iquid C hromatography (HPLC) and C apillary E lectrophoresis (CE)

1. High-PerformanceLiquidChromatography (HPLC) and CapillaryElectrophoresis(CE) Hari Sutioso ( 0806460484 ) Khairul Hadi (0806460515 ) Khotib Sarbini ( 0806340113 ) Yongki Suharya D (0806460603)

2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) • merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. • HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.

3. HPLC

4. Fase normal HPLC • Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. • Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

5. Fase balik HPLC • Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. • Pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. • Air mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit. • Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.

6. Diagram alir HPLC Solvent reservoir Pump to produce high pressure Processing unit and display Signal to processor Sample injection detector HPLC tube waste

7. Injeksi sampelInjeksi sample seluruhnya otomatis. Terjadi pada tingkat dasar dan jauh lebih rumit, karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

8. Waktu retensiAdalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor .Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: • Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) • Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) • Komposisi yang tepat dari pelarut • Temperatur pada kolom.

9. DetektorUmumnya, penggunaan serapan ultra-violet (UV) sebagai detector pada HPLC. UV detector Output from the column UV being absorbed by compound (s) in the mixture UV light

10. Interpretasi output dari detektor • Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. • Penggunaan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh ( sepanjang dilakukan kontrol terhadap kolom)

11. Pembacaan Grafik • Penggunaan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. • Meihat waktu retensi dari senyawa tersebut • Hubungan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan. • Area ( warna hijau ) yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Senyawa murni Senyawa murni(kurang pekat)

12. CAPILLARY ELECTROPHORESIS

13. ElektroforesisKolomKapiler (Capillary Electrophoresis) Merupakan suatu metode analisis kimia yang bertujuan untuk memisahkan suatu jenis ionik dengan menggunakan muatan dan gaya friksionalnya. Teknik penerapannya melibatkan suatu pipa kapiler dengan lebar 20-200 µm dengan efisiensi pemisahan tinggi baik untuk molekul besar maupun kecil.

14. KarakteristikMetoda CE: • Menggunakanpipakapilerpadapemisahanelektroforesisterjadi • Memanfaatkanmedanlistrikberkekuatantinggi, lebihdari 5 V/cm • Menggunakandetektorberteknologi modern sebagaimana yang • adapadakromatogram. • Efisiensinyakadangkalasamadengankromatografi gas kapiler, • namunjugabisalebihbesar. • Membutuhkanwaktubeberapamenituntukmengamatisampel. • Mudahdiotomatiskanuntukmenganalisisdalamsegikuantitatif, • danmudahdigunakan. • Terbatasdalammengkomsumsi(melibatkan) sejumlah reagent. • Metodeinilebihaplikatifuntukmenyeleksidalamukuranluas, • dibandingkandenganteknikseparasilainnya.

15. Instrumen: • Kolomkapiler (dengansilika, jendelaoptis agar bisadiamatiprosesnyadariluar. • Duabuahelektroda • Power supply (bisadiaturuntukbertegangantinggi) • Detector (sinar UV) • Larutan buffer besertaduabuahtempatpenyimpanannya

17. Terminologi Elektroforesis Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktu yang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom kapiler menuju jendela detektor. Hal-hal yang mempengaruhi mekanisme proses ialah mobilitas elektroforesis (electrophoretic mobility) µep(cm2/Vs), kecepatan elektroforesis (electrophoretic velocity) vep(cm/s), dan besarnya medan listrik (electric field strength) E (V/cm). Hubungannya dapat dilihat pada persamaan dibawah: (1)

18. Karakteristik Persamaan 1 • Kecepatanmerupakanhasilkalkulasidarimembagiperpindahanwaktudenganjarakpipakapilerdaridetektor. • Mobilitastergantungpadahasilpembagianantarakecepatandenganbesarmedanlistrik. Ketinggiancairansampelpadapipakapilertergantungpadajenis buffer yang dipakai, kondisi pH dantemperatur. • Panjangpipakapileryaitupanjangmenujudetektor (Ld), danpanjang total (Lt), panjangketikaprosesseparasiterjadipadasegmenkapiler, Ld , danpanjangkeselurahanadalahLt, selisihataukelebihanLtterhadapLdharusdiketahuiuntukmenghubungkanpipakapilerpada buffer reservoir. Padasistem P/ACE exceespanjangnyabernilai 7 cm, denganukuranpanjanginiapabilasusunanpipatersebutdibalikkanmakaakanterjadisuatuseparasi yang cepat.

19. Elektroosmosis Merupakan proses dasar yang mengendalikan CE, peristiwa ini merupakan hasil dari terdapatnya muatan pada dinding pipa kapiler. Aliran elektroosmosis didefenisikan dalam persamaan dibawah: (2) Dimana є adalah konstanta dielektrik, η adalah viskositas larutan buffer , dan ζ adalah potensial zeta diukur pada saat bidang pembatas menutup pada hubungan permukaan antara liquid dan padatan. Muatan negatif dinding menarik muatan positif ion dari larutan buffer, menghasilkan dua lapisan elektrik. Ketika tegangan yang dilibatkan melewati pipa kapiler, kation yang ada didalam jumlah yang panjang (banyak)pada lapisan ganda (double layer), berpindah secara langsung kadalam katoda dengan mengikutsertakan air. Hasilnya adalah jaringan aliran larutan buffer pada elektroda negatif. Meningkatnya konsentrasi akan mengakibatkan aliran elektroosmosisnya menjadi menurun.

20. Pada gambar 2 diatas, diperlihatkan pengaruh pH terhadap EOF, ion zwiter seperti peptida telah dipisahkan kedalam dua kondisi pH, pada pH tinggi EOF besar dan peptida bermuatan negatif sehingga perpindahan elektroforesis menuju kearah elektroda positif (anoda),

21. Dinamika aliran, efisiensi, dan resolusi Pada saat aliran pada pipa kapiler diberikan suatu pendorong yaitu tekanan maka akan terlihat perbedaan kecepatan aliran yaitu pada lintasan tengah pipa lebih cepat dibanding dengan pada dinding, hal ini terjadi karena ada gaya friksional(gesek) liquid terhadap dinding kapiler (sistem hidrodinamik). Gambar bagian atas menunjukkan sistem yang dikendalikan secara elektris, gaya dorong pada EOF terdistribusi secara uniform(merata) sepanjang pipa tersebut, sehingga tidak ada pengaruh tekanan, distribusi kecepatan merata kecuali pada bagian yang dekat sekali pada dinding pipa kapiler.

22. Nilai kecepatan aliran dapat ditentukan berdasarkan persamaan dasar: (3) Waktu yang dibutuhkan untuk berpindah (migration time) ialah: (4) Sepanjang berpindah , terjadi difusi molekular kemudian memuncak pada dispersi, persamaan dispersi sebagai berikut: (5) Dimana Dm adalah koefesien difusi larutan cm2/s

23. Angka teoritis pelat alas diberikan dalam persamaan sebagai berikut: (6) Mensubtitusikan persamaan 5 kedalam persamaan 6 (7)

24. Diameter Kapiler dan Panas Joule Penggunaan tegangan listrik yang tinggi mengakibatkan terdapatnya panas yang terhimpun dalam sistem. Ada dua masalah yang cukup besar yang timbul sebagai akibat dari panas yang dihasilkan, yaitu gradien temperatur yang melintasi kolom kapiler dan pertukaran temperatur dalam beberapa waktu menjadi tidak efektif terhadap panas yang hilang. Kecepatan panas yang dihasilkan pada kolom kapiler dapat ditinjau melalui pendekatan persamaan sebagai berikut (8) Dimana L adalah panjang pipa kapiler, A adalah luas area yang dialiri. Apabila i=VR dan R=L/kA sedangkan k adalah koduktivitas maka: (9)

25. Gradien temperatur yang melintas pada kolom kapiler merupakan akibat dari dissipasi panas, temperatur pada aliran tengah kolom kapiler lebih tinggi dibandingkan dengan temperatur pada dinding kapiler. Viskositas akan menjadi lebih rendah pada saat temperatur tinggi, dalam kondisi ini pula EOF dan mobilitas elektroforesis (EPM) juga akan meningkat.

26. Gradien temperatur sebanding dengan kuadrat diameter dari pipa kapiler, dapat dilihat melalui persamaan dibawah: (10) Diman W adalah usaha, r merupakan jari-jari kapiler, dan K adalah konduktivitas termal.

27. Efek Tegangan dan Temperatur Aliran elektroosmosis dan kecepatan elektroforesis sebanding dengan kuatnya medan listrik, sehingga pemberian tegangan begitu tinggi akan mempercepat proses separasi, umumnya proses separasi terjadi pada kondisi temperatur 25oC (mendekati suhu kamar). Dengan mendinginnya liquid pada kolom kapiler, maka akan mudah untuk melakukan pengontrolan temperatur, pada saat buffer yang digunakan tersebut berkonsentrasi tinggi dan dengan lebar pipa kapiler yang agak besar. Ketika terdapat masalah dalam melakukan pengontrolan temperatur maka solusi yang biasa ditempuh adalah dengan menggunakan pipa kapiler yang lebih kecil, karena hal itu bisa menekan pemakaian arus dan mengurangi panas.

28. Metoda Injeksi Sampel Gravitasi Tekanan Elektrokinetik

29. Metode-metode Elektroforesis kolom kapiler • Capillary Zone Electrophoresis • Isoelectric Focusing • Capillary Gel Electrophoresis • Isotachophoresis • Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography

30. Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Merupakan metode yang paling sederhana dari CE, mekanisme separasinya berdasarkan pada perbedaan rasio muatan-massa. Dasar-dasar CZE adalah keseragaman larutan buffer dan besarnya medan listrik yang tetap pada sepanjang kolom(pipa) kapiler. Komponen-komponen sampel terpisah menjadi zona-zona khusus yang bisa diamati pada gambar dibawah, untuk menentukan mobilitas elektroforesisnya maka digunakan persamaan dari teori Debeye-Huckel-Henry (11) Dengan q adalah muatan netto, R jari-jari Stokes, dan η adalah viskositas.

31. Separasi molekul-molekul kecil dan besar dapat dilakukan dengan baik dengan metode CZE. Meskipun pada molekul yang lumayan kecil dimana rasio antara muatan dan massanya tidak begitu bagus.

32. Aplikasi CZE sangat berguna untuk men-separasi protein dan peptide, hasil yang didapat akan dianalisa perbedaannya berdasarkan satu subtituent dari asam amino. Hal ini berguna dalam memetakan tempat modifikasi mutasi dan post-translasi yang terdeteksi.

35. Isoelectric focusing(IEF) Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terus berlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberi muatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akan berhenti bergerak.

36. Aplikasi IEF berguna untuk menentukan pI dari protein, terutama dalam memisahkan immunoglobulin , variasi hemoglobin dan menentukan posisi translational modifikasi dari protein rekombinan, separasi campuran protein dapat dilihat pada gambar dibawah:

37. Capillary Gel Electrophoresis Metode seperti ini dilakukan dengan melibatkan gel, gel diisikan kedalam pipa kapiler contohnya polyacrylamida, dan agarosa. Metode ini penting diterapkan pada saat melakukan separasi DNA.

38. Aplikasi • DNA Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agar polyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi

39. Isotachophoresis Pada metode ini aliran elektroosmosis sama dengan 0, sistem pada buffer adalah heterogen, pipa kapiler diisi dengan larutan elektrolit yang memiliki mobilitas tinggi dibandingkan sampel-sampelnya yang akan diteliti sebagai leading , kemudian sampel diinjeksi, kemudian larutan elektrolit kembali dimasukkan kembali sebagai terminating.

41. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography Micellar merupakan agregat molekul yang ampifilik yang dikenal sebagai surfaktan, micelle berkemampuan untuk menganalisis analit pada level molekular berdasarkan interaksi hidrofobik dan elektrostatik.

42. Aplikasi

43. Terima Kasih......