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Apoptosis

Apoptosis. Qué es apoptosis ?¿ (Kerr, 1972) Es una forma de muerte celular Cumple un rol crítico en el desarrollo Anomalías pueden producir cáncer y autoinmunidad

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Apoptosis

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Presentation Transcript

  1. Apoptosis • Qué es apoptosis ?¿ (Kerr, 1972) • Es una forma de muerte celular • Cumple un rol crítico en el desarrollo • Anomalías pueden producir cáncer y autoinmunidad • La señalización ocurre por medio de múltiples vías (dos vías principales: mediada por la mitocondria y mediada por los receptores de muerte) • Todas las vías convergen a un único sistema de proteasas efectoras (CASPASAS)

  2. Donde podemos ver procesos apoptóticos ?¿ • Desarrollo embrionario • Homeostasis Celular • Inmunología • Enfermedades Virales • Enfermedades neurodegenerativas

  3. Diferencias entre apoptosis y necrosis • Apoptosis • Efecto de burbujas en la membrana • Encogimiento de la célula • Aparición de cuerpos apoptóticos • Requiere ATP • No ocurre a 4ºC • Fragmentación del ADN (Ladder) • Puede morir una única célula • No inflamación • Necrosis • Perdida de la integridad de la membrana • La célula se hincha • No hay formación de ´vesículas • No se requiere energía • Puede ocurrir a 4ºC • Digestión al azar del ADN • Mueren grupos de células • Procesos inflamatorios presentes

  4. Características generales de la Apoptosis • Condensación de la cromatina y encogimiento celular • Activación de receptores de Muerte • Dimerización de miembros de la familia de bcl-2 • Se hincha la membrana externa de la mitocondria, produciendo la liberación de citocromo c • Activación de caspasas • Activación de DNAsas • Translocación de Fosfatidilserina • Dependencia de ATP • Fragmentación del ADN (“Ladder”)

  5. CASPASAS Las caspasas son cisteín-proteasas y clivan sustratos después de un Asp. Existen muchas y la especificidad esta dada por los 4 residuos anteriores al sitio de corte. Son sintetizadas en forma de procaspasas inactivas, pudiendose autoactivar clivandose ellas mismas. Clivan e inactivan las enzimas de los sistemas reparadores del ADN. • Caspase-1 (ICE) • Caspase-2 (ICH-1, Nedd-2) • Caspase-3 (CPP32, Apopain, Yama) • Caspase-4 (ICH-2, TX, ICEreıı) • Caspase-5 (ICErelııı, TY) • Caspase-6 (Mch2) • Caspase-7 (ICE-LAP3, Mch3, CMH-1) • Caspase-8 (FLICE, Mch5, MACH) • Caspace-9 (Mch6, ICE-LAP6) • Caspase-10 (Mch4)

  6. Proceso Apoptótico Inducción Moduladores Efectores Sustratos MUERTE • Deprivacion de factores de crecimiento • Hipoxia • Pérdida de adhesión • Activación de receptores de muerte • Radiación • Inducción química • CASPASAS • FADD • TRADD • FLIP • Bcl-2 • Citochromo c • p53 • Mdm2 • Varias proteínas celulares • ADN

  7. Normal Con burbujas Con puntas Ampolla Células apoptóticas en cultivo

  8. Necrosis Apoptosis Células apoptóticas

  9. Células apoptóticas

  10. Detección de apoptosis • Análisis de ADN (Gel de agarosa) • Marcado de los extremos del ADN fragmentado • Tinción de la fosfatidilserina expuesta y posterior cuantificación de las células positivas • Microscopía en tiempo real (Video) • Citometría de flujo • Morfología (Tinción con colorante de Hoechst) • Microscopía electrónica

  11. Análisis de ADN (Gel de agarosa) • Gel de agarosa de 2 % • Tinción con bromuro de etidio, SYBR-Green, SYBR-Orange, Real-Blue, • Desarrollo electroforético: Voltage constante (100V) y tiempo 1:40 hs • Por ser un desarrollo electroforético de larga duración, asegurarse de mantener las condiciones refrigerantes adecuadas

  12. Visualización de productos de ADN

  13. “Ladder” (Escalera de ADN fragmentado)

  14. Problemas con el “Ladder”

  15. Software • Programas del paquete Image Gauge de Fujifilm • Programa del paquete Digital Science y Science Lab de Kodak • ImageQuant, ImageMaster y ArrayVision Software de AmershamBiosceinces Hardware • Cámaras digitales de 5 a 12 MegaPixels • Transiluminadores potenciados con luz UV de (270 y 305 nm)

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