Solunum Yolunun Primer Hücre Kültürleri Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr Toraks 10.Yıllık Kongresi, Antalya 25-29 Nisan 2007
Amaç • Solunum yolunun primer hücre kültürleri hakkında bilgi sahibi olma • Solunum yolu hücre kültürlerinin araştırmalarda kullanımı ve sağladığı olanaklar hakkında bilgi sahibi olma • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme
İçerik • Neden primer hücre kültürleri; kullanımı, avantajları • Nelere ihtiyaç duyulur? • Düz kas hücreleri • Fibroblast kültürleri • Alveolar epitel hücreleri • Bronş epitel hücreleri
Primer Hava Yolu Hücre Kültürleri – Olanaklar • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs
Primer Hücreler-Avantajlar • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler
Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar • Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar
Primer Hava Yolu Hücreleri Nasıl Elde Edilirler?
Biyogüvenlik Kabini
CO2 İnkübatörü • %5 CO2 • 37 °C • Nemlendirilmiş ortam
Hücre Kültür Kapları Hücre Kültür ‘Flask’ı
Hücre Kültürü Vasatı
Doku-Hücre Kaynağı • Hayvan • İnsan
Doku - Hücre Kaynağı • Cerrahi eksplant • Pnömonektomi, Lobektomi • Transplant akciğeri • Biyopsi • Fırçalama (epitel hücreler) • Enzimatik digestion, • Disseksiyon • Hazır, ticari olarak
Hava Yolu Düz Kas Hücreleri
Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-1 • Trakea veya bronş halkalarından • Diseksiyon ile düz kas ayrıştırılır, temizlenir, • 1mm3 parçalara ayrılır • Kültür kapları/flasklara konur - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820. - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.
Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-2 • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), %10 fetal buzağı serumu (FCS), L-glutamin, sodium pyruvate,anti-mikrobial ajan • Trypsin ile yerlerinden ayrılır • Kültür kaplarına transfer - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820 - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.
Hava Yolu Fibroblast Kültürleri
Fibroblast Kültürleri • Lobektomi veya pnömonektomi eksplantı • Tümorsüz doku 3-5mm parçacıklara ayrılır • %10 FCS ile kaplanan flasklara konur • Flask yüzeyini kaplayan hücreler tripsin ile yerlerinden ayrılarak ileri pasajlar elde edilir. - Eickelberg O, et al. Am J Physiol 1999; 276: L814–L824.
Alveol Epitel Hücre Kültürleri Alveol epitel Hücreleri ( Tip I ) Bazal membran Alveol epitel Hücreleri ( TipII )
Alveol Epitel Hücre Kültürleri-1 • Konsolide olmayan, hemoraji gelişmeyen AC eksplantı • Pulm. Arter PBS ile infüzyon • Distal hava yollarına elastaz içeren HBSS • Akciğer DNAse ve FCS varlığında kıyılır • Hücreden zengin fraksiyon ayrılır • Santrifüje edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.
Alveol Epitel Hücre Kültürleri-2 • Tip 2 pnömosit ve alveolar makrofajdan oluşan bant toplanır • Santrifüj edilir • Anti-CD14 ile kaplı manyetik bilyeler ile inkübe edilir • Manyetik bilyeler, mıknatıs ile ayıklanır • Kalan hücreler inkübe edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.
Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri • Fırçalama, • Enzimatik digestion, • Disseksiyon
Bronş Epitel Hücreleri-FIRÇALAMA • Bronkoskopi ile taze hücreler alınır • Kollajen ile kaplı kültür flasklarına alınır • Serumsuz, hormonla zenginleştirilmiş bronşiyal epitelyum büyüme vasatı • Antibiyotikli ortamda • 37 °C, %5 CO2’li, nemlendirilmiş ortamda inkübasyon Bucchieri, F et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med.2001
Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu
Kültür Vasatı • ‘Medium 199’ • Foetal bovine serum (2.5ml) • 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) • 1ml human transferrin (2.5 g/ml) • 1ml epidermal growth factor (20g/ml) • 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) • 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) • 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir
Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı
Doku eksplantından çoğalan hücreler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
Deneye hazır 2-3 haftalık kültürler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümü M M D S S D x56,000 x30,000
Hücrelerin DEP ile İnkübasyon
Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi
DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir CellMol Biol 1998.
Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/g selüler protein Non-ast. Ast. p<0.05 (log.) p<0.003 p<0.002 YK IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.
DEP ile 24s inkübasyondan sonra non-astmatik ve astmatik bronş epitel hücrelerinden IL-8 salınımı Non-asthmatics Asthmatics Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.
İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği NO2 %5 CO2 İn Air
Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği
Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.
Ozon ve NO2’e 6s maruziyetin astmatik bronş epitel hücrelerinden GM-CSF salınımına etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 2001.
Loratadinin 400ppb NO2’nun Bronş EpitelHücrelerinden Yol Açtığı IL-8 Salınımına Etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1999.
Özet • Solunum yolunun primer hücre kültürleri laboratuar ortamında elde edilebilir • Solunum yolu hücrelerinin fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri araştırılabilir • Hastalıkların patogenezinin aydınlatılmasında yararlanılabilir • Toksik ajanların etkileri araştırılabilir • Terapötik ajanların etkileri araştırılabilir
Yorum • Bütün dünyanın yaygın olarak kullandığı hava yolu hücre kültürü olanaklarından Türkiye’deki araştırmacılar da yararlanmalıdır
Teşekkür St Bartholomew’s and The Royal London School of Medicine and Dentistry • Prof RJ Davies • Dr JL Devalia • RJ Sapsford • Dr OA Khair • Dr MA Abdelaziz • Dr C Rusznak Dicle Universitesi
Sabrınız İçin Teşekkür Ederim
