2 rodzaje cytometrów przepływowych: analizator sorter

1. Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty) • 2 rodzaje cytometrów przepływowych: • analizator • sorter

2. Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

3. Budowa cytometru

4. Część hydrauliczna • transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej • zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów • ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

5. Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne) zawiesina próbki • zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy • płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki • przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi płyn osłaniający

6. Część hydrauliczna • szybkość przepływu 12 – 300 ul/min. • szybkość akwizycji 300 – 50 000 komórek/s • szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

7. Układ optyczny

8. Fluorescencja w układzie optycznym Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

9. Fluorescencja w układzie optycznym • Prawo Stokes’a • długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnegojest zawsze większa od długości fali promieniowaniawzbudzającego fluorescencję • Przesunięcie Stokes’a • - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny 520 nm 495 nm Intensywność fluorescencji Długość fali

10. Rodzaje stosowanych fluorochromów • autofluorescencjaNADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan • białka wykazujące fluorescencję • GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP • DsRed • 3. aromatyczne związki organiczne • fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor • 4. kropki kwantowe http://www.microscopyu.com

11. Budowa kropek kwantowych • rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu • powłoka siarczkowo-cynkowa • powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) • cząsteczka biologiczna Molecular Probes

12. Właściwości kropek kwantowych: • rozmiar zbliżony do dużego białka • jednakowe spektrum absorpcji • rozmiar kryształu determinuje barwę emisji • silna fluorescencja • ‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

13. Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

14. Układ optyczny rodzaje filtrów górnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

15. Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

16. Układ elektroniczny • przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy • pomiar wielkości napięcia • przeprowadza kompensację

17. Wykresy dwuwymiarowe konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x-y rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń

18. histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeń histogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń

19. Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

20. Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii laser detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość Purdue University Cytometry Laboratories

21. Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych SSC Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser FSC • Rozproszenie na wprost • Określa wielkość komórki • Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost • Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone • Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) • Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej

22. Rozproszenie na wprost (FSC) Wielkość Laser mała ~ mały FSC Laser duża ~ wysoki FSC

23. Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkości NEUTROFILE FSC MONOCYTY 200 400 600 800 1000 0 90 Degree Scatter LIMFOCYTY SSC Purdue University Cytometry Laboratories

24. Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji detektor przedni laser Ilość komórek Fluorescencja detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

25. Zasady analizy FACS – analiza fluorescencji żółta fluorescencja zielona fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

26. Zasady sortowania metodą FACS • na zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher-tube sorting’) • słaba wydajność (300 komórek/s) • duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

27. Zasady sortowania metodą FACS • sortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze kroplew zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek • możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie • szybkość sortowania do 70 000 komórek/s

28. kryształ piezoelektryczny

29. Wykorzystanie • ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji) • oznaczanie antygenów HLA (transplantologia) • oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych) • ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia) • identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka) • sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy) • sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

30. M G2 G0 / G1 G0 G1 Count G2 / M S S 0 200 400 600 800 1000 zawartość DNA 4N 2N Przykład zastosowania Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego

31. HISTOGRAM DNA • pik G0-G1odpowiada • ilości DNA = 2n • w fazie G0i G1 G0-G1 G2-M • obszar S to rozkład • zawartości DNA w • fazie S cyklu • komórkowego ilość komórek S • pik G2-M odpowiada • ilości DNA = 4n • w fazie G2i M intensywność fluorescencji PI

32. Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002.

33. Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002.

34. Mikroskopia konfokalna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002. http://www.microscopyu.com/tutorials/java/virtual/confocal/index.html

35. Dekonwolucja w mikroskopii Zaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/deconvolution/deconintro.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/deconvolution/deconalgorithms.html