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PCR en Tiempo Real

PCR en Tiempo Real. ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo. PCR en Tiempo Real. PCR convencional. Ventajas. Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización

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PCR en Tiempo Real

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Presentation Transcript

  1. PCR en Tiempo Real

  2. ADN molde • Primers • Taq polimerasa • dNTPs • MgCl2 • Buffer • Fluorocromo

  3. PCR en Tiempo Real PCR convencional

  4. Ventajas Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

  5. No específico • Curva de disociación • Económico • SYBR Green

  6. SYBR Green

  7. No específico • Curva de disociación • Económico • SYBR Green

  8. FAM: fluoresceína JOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceína TAMRA: tetrametil-rodamina ROX: rodamina X

  9. LUX™ primers

  10. Sondas TaqMan®

  11. Molecular Beacons ®

  12. Sondas Scorpions™

  13. A mayor producto de amplificación mayor fluorescencia!!!!

  14. Muestra ΔRn Rn Threshold Control Negativo Basal Ct Número de ciclos

  15. Rn:intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX). • Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia. • Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia. • Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias. • ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.

  16. Controles endógenos: β-Actina rARN 18S GAPDH β2-microglobulina

  17. Métodos de cuantificación • Cuantificación Absoluta • Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt:compara los Ct del gen testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores. (EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc) r= 2 -(ΔΔCt)

  18. b) (Etarget)ΔCt target(control-muestra) r= (Eendógeno)ΔCt endógeno (control-muestra) E= 10 [-1/ pendiente]-1

  19. Curva de disociación • Contenido de GC. • Secuencia y tamaño del amplicón.

  20. Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt) Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina. Tejido calibrador:hígado de rata.

  21. Curva de Rango Dinámico TRalfa

  22. Curva de Rango Dinámico Beta Actina

  23. Puesta a punto: • cDNA • Primers (Calibrador!!!!!)

  24. Target: TRalfa (m ycalibrador) • Master Mix Endógeno: BetaActina(m y c) NTC!!!

  25. Ej. Discriminación Alélica (Taqman) Objetivo:determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2. Alelos: Ala12 Pro12

  26. Sonda 1 (FAM) Sonda 2 (VIC) Alelo 1 Alelo 2 Match Match Mismatch Mismatch

  27. Homocigota alelo 1: Heterocigota: Homocigota alelo 2:

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