Download
1 / 14
140 likes | 312 Vues
Talajvizsgálat kataláz aktivitás méréssel. Enzimvizsgálati módszerek. A kataláz enzim (1). A kataláz gyakori enzim, mely szinte minden élő szervezetben megtalálható, ami oxigénnek van kitéve. A kataláz enzim (2). Katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné.
E N D
Talajvizsgálat kataláz aktivitás méréssel Enzimvizsgálati módszerek
A kataláz enzim (1) • A kataláz gyakori enzim, mely szinte minden élő szervezetben megtalálható, ami oxigénnek van kitéve.
A kataláz enzim (2) • Katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné. • Egy kataláz enzim 40 millió hirdogén-peroxid molekulát tud vízzé és oxigénné bontani. • 4 azonos polipeptid láncból felépülő enzim, minden egység több, mint 500 aminosav hosszú. • Működési mechanizmusa:
A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (1) • A katalázfunkciója a mérgező hidrogén-peroxid bontása: H2O2 → H2O + 1/2 O2 • A gerjesztett hidrogén-peroxid mérgező a sejtekre, oxidálja a fehérjék SH-csoportjait. • Az aerob sejtek rendszerint tartalmazzák a szuperoxid dizmutáz enzimet, mely átalakítja a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné: 2O2- 2H+ → H2O2 + O2
A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (2) • Az L- és D-amino sav oxidáz redukált formái közvetlenül képesek reoxidálódni hidrogén peroxid formába molekuláros oxigénnel: E-FMNH2 + O2 → E-FMN +H2O2 E-FADH2 + O2 → E-FAD +H2O2 • Minden aerob baktérium és a fakultatív anaerob baktériumok zöme foglal magában kataláz aktivitást. • Az enzim nem észlelhető obligált anaerob baktériumokban. • A kataláz volt az első enzim, amit vizsgáltak a talajban. Ez alapozta meg az O2 kibocsátás meghatározását.
A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (3) • A kataláz aktivitást észlelték növényi és állati sejtekben. • Ráadásul, a Mn és a Fe, valamint a szerves anyagok a talajokban katalizálják az O2 felszabadulását a hidrogén-peroxidból. • A kataláz aktivitás nagyon stabil a talajban. Ezt mutatják a fontos összefüggések a szerves szén tartalommal és a talaj mélységének csökkenésével. • Nem találtak összefüggést a kataláz aktivitás és a talaj termékenysége között
Az eljárás alapelve • A módszer a talaj hidrogén-peroxiddal, három percig, szobahőmérsékleten történő inkubálása után felszabaduló oxigén térfogatbecslésén alapul.
Anyagok és segédeszközök • Erlenmeyer lombikok (200ml) • Mágneses keverő • Scheibler berendezés • Ha a Scheibler berendezés nem érhető el, egy U-üveg cső, Brodie oldattal töltve felhasználható a térfogat mérésére.
Vegyszerek és oldatok • Foszfát puffer (0,2 M, pH 6,8) Oldjunk 35,63 g Na2 hidrogén fosztfátot 700 ml desztillált vízben, igazítsuk a pH-t 6,8-ra HCl-el és 1000 ml desztillált víz higítással. • Nátrium karbonát oldat (10%) Oldjunk 100g Na2CO3-ot körülbelül 800 ml desztillált vízben és öntsük fel desztillált vízzel 1000 ml-ig. • H2O2 (3%) Közvetlenül a használat előtt készítsük elő. • Nátrium azid oldat (6,5%) 6,5 g 100 ml-1 desztillált víz • Brodie oldat • MnO2
Az eljárás (1) • Helyezzünk 5-10 g nedves vagy száraz talajt egy Erlenmeyer lombikba (200 ml) és adjunk hozzá 20 ml foszfát puffert. • Készítsük elő az ellenőrzőket, adjunk hozzá 2 ml azid oldatot és 20 ml foszfát puffert. • Forgassuk meg a lombikot és hagyjuk állni 30 percig. • Pipettáljunk 10 ml H2O2-ot (3%) a Scheibler berendezés kis tartályába. • A lombik bezárása után keverjük a hidrogén-peroxidot a talaj mintával és inkubáljuk folytonos keverés mellett 3 percig szobahőmérsékleten (20 oC).
Az eljárás (2) • Majd olvassuk le a gáz térfogatváltozását a Scheibler berendezésben vagy az U-üveg csőben. • Az átalakult oxigén meghatározásához tegyünk 0,5 g MnO2 és 20 ml nátrium karbonát oldatot (10 %) a talaj helyett egy Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 10 ml H2O2-ot (3 %) és olvassuk le a térfogat változását a Scheibler berendezésben (vagy az U-üveg csőben). • Az átalakult oxigént tekintjük 100 %-nak.
Számítás Ahol: • D0 az azid hiányában fejlődő O2 mililiterben, • DA azid jelenlétében fejlődő O2 mililiterben, • DMn a Mn jelenlétében fejlődött O2 mililiterben, • dwt a talaj száraz tömege (%).
Diszkusszió • Az azid használható az abiotikus H2O2 hidrolízis számításához. • A nedves vagy levegőn szárított talajok szobahőmérsékleten 4 hónapig raktározva nem mutatnak kataláz aktivitást. • A peszticidek gátolhatják vagy aktiválhatják is a talaj kataláz aktivitását, az összetételtől függően. • Összefüggést találtak a kataláz és a dehidrogenáz aktivitás között, azonban a kataláz és az amiláz aktivitás vagy a baktérium szám között csupán gyenge az összefüggés, vagy nincs.
Források • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): MethodsinAppliedSoilMicrobiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 • Catalase:http://en.wikipedia.org/wiki/Catalase • A kataláz enzim szerkezete és működése: http://www.chem.science.unideb.hu/Oktatas/K3125/K3125Eload5.pdf (20.oldal) • Catalasestructure: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Catalase_Structure.png • Növényélettan jegyzet: marssoniella.uw.hu/4elettan.doc • AP BiologyLab 2: Enzymecatalysis: http://biowithberkeley.blogspot.com/2007/10/ap-biology-lab-2-enzyme-catalysis.html
