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La DD RT-PCR

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  1. La DD RT-PCR • DDRT-PCR : Differential Display Reverse Transcription - Polymerisation Chain Reaction • Technique basée sur la RT-PCR • Technique de tri d’ARNm : differential display • Développée par Liang P. et Pardee A. B. en 1992 • Différences d’expression de gènes entre 2 cellules dans des conditions différentes

  2. Cellules A : (même principe pour cellules B) Isolation des ARNm AAAAAA Hybridation (amorce T12AC) – RT. AAAAAA Idem avec d’autres amorces T12XY. AAAAAA GUAAAAAA CATTTTTT GUAAAAAA CATTTTTT Hybridation (amorce aléatoire) Elongation. Idem avec d’autres amorces aléatoires. NNNNNN GUAAAAAA NNNNNN CATTTTTT NNNNNN GUAAAAAA NNNNNN CATTTTTT Principe du DD RT-PCR

  3. NNNNNN GUAAAAAA NNNNNN CATTTTTT Résultat obtenu après PCR avec les différentes amorces utilisées. NNNNNN GUAAAAAA NNNNNN CATTTTTT Electrophorèse sur gel de polyacrylamide: amorce 1 amorce 2 amorce 3 etc… A B A B A B Excision et clonage :  gène sous-exprimé dans B. Excision et clonage :  gène sur-exprimé dans B. Principe du DD RT-PCR

  4. Méthodes dérivées • AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR • DDRT-PCR with Selected Primers (SPR) • Targeted Display • Ordered Differential Display (READS)

  5. Méthodes dérivées • AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR • DDRT-PCR with Selected Primers (SPR) • Targeted Display • Ordered Differential Display (READS)

  6. AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR RT : amorce oligo(dT)  amorces d’oligonucléotides arbitraires ARN qui ne sont pas polyadénylés (ex : bactéries).  Minimiser amplification région 3’ non codante. Limite : choix des amorces et abondance des ARN définissent différenciation finale.  deux amorces arbitraires risquent d’augmenter l’amplification de mismatch.

  7. Méthodes dérivées • AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR • DDRT-PCR with Selected Primers (SPR) • Targeted Display • Ordered Differential Display (READS)

  8. DDRT-PCR with Selected Primers • Choix expérimentale d’amorces arbitraires • Meilleure amplification des ARNm abondamment transcrits. • Éliminer le maximum de faux positifs. - Taux de G et C dans l’amorce  diminuer l’amplification d’ARNr et d’ARN mitochondriaux (dans le cas de la RAP-PCR). - Cycles PCR à température = 50°C  augmente la sélectivité et la reproductibilité mais aussi le nombre de bandes . - PCR avec une seule amorce en 3’  meilleure étude des transcrits très abondants. - PCR quantitative  confirmer les différences d’expression.  Observer les transcrits très abondants au détriment des transcrits faiblement exprimés.

  9. Méthodes dérivées • AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR • DDRT-PCR with Selected Primers (SPR) • Targeted Display • Ordered Differential Display (READS)

  10. Targeted Display • Identification de transcrits : • - membres d’une même famille de gènes, • - avec domaines spécifiques, • - avec motifs particuliers. • RT : amorce oligo(dT) • PCR : amorce spécifique domaine homologue à une famille de gènes ou domaine spécifique.  différences d’expression entre des transcrits à l’origine de facteurs de transcription à domaine spécifique.  observer des transcrits à motifs répétés souvent à l’origine de maladies neurodégénératives (ex : Corée de Huntington).

  11. Méthodes dérivées • AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR • DDRT-PCR with Selected Primers (SPR) • Targeted Display • Ordered Differential Display (READS)

  12. Principe : Ordered Differential Display (READS) READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed Sequences

  13. Ordered Differential Display (READS)

  14. Principe : Ordered Differential Display (READS) READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed Sequences  Meilleure reproductibilité des résultats que DDRT-PCR.

  15. Applications DDRT-PCR  Visualiser des différences d’expression de gènes Exemples : • Cellules d’organes différents d’un même organisme •  définir gènes spécifiques de chaque organe. • Cellules dans conditions environnementales différentes: • - température, • - la salinité (pression osmotique), • - la pression des gaz (O2, CO2 …), • - la luminosité, • - les nutriments (source d’azote, sucres, acides aminés, molécules pharmaceutiques …), • - etc.… • définir gènes spécifiques de ces conditions.

  16. Applications DDRT-PCR  Visualiser des différences d’expression de gènes Exemples : • Cellules en présence : • - pathogène (insecte, champignon, bactérie…) • - symbiose • - blessure •  définir gènes spécifiques.

  17. Avantages et Limites Avantages : • Fondée sur PCR : • - peu de matériel  1 µg ARNm poly(A)/échantillon  150 réactions • - peu onéreuse. • Identification gènes sur et sous-exprimés sur un même gel. • Plus rapide que techniques de criblage différentiel. • Beaucoup de comparaisons entre échantillons grâce à combinaisons d’amorces différentes.

  18. Avantages et Limites Limites : • Saturation pour gènes fortement transcrits  sous estimation de la bande. • Beaucoup de faux positifs dans les fragments de PCR clonés : un problème intrinsèque à la méthode. • Une bande : plusieurs fragments d’ADNc différents, de même longueur.