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Molecular Biology Presentation

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rob
12 diapositives · 259 Views · Oct 15, 2014

This presentation discusses the methods and outcomes of molecular biology experiments conducted by Group 13. Key topics include ligation experiments analyzed through LB plates, where both negative and positive controls demonstrated the effectiveness of ampicillin. The results of DNA electrophoresis indicated successful transformation of vectors into DH5α strains. Additionally, SDS-PAGE was performed to evaluate protein expression and purification, with observations noted regarding transfer efficiency to PVDF membranes. Issues encountered during experiments are also addressed, along with suggested improvements.

Molecular Biology Presentation - slide 1
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Transcription de la présentation

  1. Molecular Biology Presentation 生醫三 Group 13 992334 林思慧 992339 黃珮瑄

  2. LB plate Negative control Positive control Ligation 13-1 Ligation 13-2

  3. Plasmid DNA 13 M P L1 L2 13* P* L1* L2* 13 P L1 L2 13* P* L1* L2* 8.0kb 3.0kb 1.0kb 0.5kb M:marker L:ligation P:positive Black:person 1 (思慧) Blue:person 2 (珮瑄) * :treated with restriction enzyme

  4. Discussion • 塗菌的時候沒有塗均勻，colonies沒有分散，挑菌的時候不易找到單一的菌落。 • 塗菌時取的菌液量(300μl)太多，菌長得很密。 • 跑DNA電泳時，因為在loadDNA不小心太快，部分DNA會被沖到well外，使得跑出來的兩組band亮度稍微不同。

  5. Summary • 塗盤 • Negative control知道Ampicillin有效抑制雜菌生長 • Positive control中攜帶抗Amp gene的細菌能夠生長 • Ligation的LB plate上都是攜帶抗Amp gene的DH5α菌株 • DNA電泳 • 經酵素切過後，ligation1&2在1kb的位置都有跑出band，即transformation有成功將帶有DNA片段的vector轉入DH5α菌株中。

  6. SDS-PAGE (CBR) Purification No Purification GST GST-D IPTG GST-D GST-D GST-D GST GST GST-D GST GST M - + - + 75kDa + - + - + - + - 28kDa - : No Purification + : Purification

  7. PVDF membrane (Antibodies) Purification No Purification GST-D GST-D GST-D GST GST GST-D GST GST M 75kDa 28kDa

  8. PVDF membrane (CBR) Purification No Purification GST-D GST-D GST-D GST GST GST-D GST GST M 75kDa 28kDa

  9. Discussion • 在封膠的時候有小泡泡，所以膠有龜裂的現象 • 可能配膠時沒有做好，所以不管是maRker還是蛋白跑的結果中會看到糊掉的maRker或染出直線狀痕跡 • Transfer過程沒有完全趕掉泡泡，阻擋protein與PVDF結合，但是在這裡不影響實驗結果的觀察 • 可能Transfer到PVDF membrane上的蛋白量很少，或者抗體作用不完全，導致免疫染色的結果不佳

  10. Summary • 經過IPTG誘導基因表達並加以純化，western blot結果在~28kDa有大量蛋白的表現。 • 由PVDFmembrane上的CBR檢測結果可知PVDF membrane上是有蛋白成功transferred。利用免疫染色更容易探討單一個蛋白的表現。這個部分實驗可以再次做確認。

  11. References • 慧眾生物科技有限公司-1kb DNA Ladder DL1000 http://www.bioman.com.tw/pr_cont.asp?id=3&myarea=1

  12. Thank for your attEntion!