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Meningitis bacteriana

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  1. Meningitis bacteriana Diagnóstico por el Laboratorio Cecilia Vescina Sala Microbiología. Hospital de Niños. La Plata microbiologialudovica@gmail.com

  2. Dada la significativa morbi-mortalidad asociada a la meningitis bacteriana, es necesaria la información exacta de los agentes etiológicos y de la población en riesgo para tomar medidas de salud pública y asegurar el manejo adecuado. Clin Micr Rev 2010; 23:247-92

  3. Cultivo: “gold standard” Agente causal Sensibilidad antibiótica • Caso • Contactos • Vigilancia epidemiológica • Estrategias de vacunación

  4. Herramientas adicionales • Pruebas rápidas • PCR • Hemocultivos • Marcadores séricos de inflamación • Antígenos urinarios

  5. Sensibilidad de diferentes métodos diagnósticos para determinar la etiología en pacientes con meningitis bacteriana adquirida en la comunidad Clin Microbiol Rev 2010;23:467-492 /858-883

  6. Algoritmo de trabajo LCR CITOFISICOQUÍMICO CULTIVO PCR Directo: Gram Agar chocolate Tioglicolato Choc/Sac/Mg Caracterización del agente etiológico: Nm: Gram, oxidasa, azúcares, aglutinación sueros monoespecíficos Spn: Gram, optoquina, sol. bilis, ATB Hi: Gram, factores, aglutinación sueros monoespecíficos, ATB Cultivo negativo INFORME

  7. Exámen citofisicoquímico del LCR Hallazgos característicos: • Pleocitosis • Hipoglucorraquia • Aumento de las proteinas

  8. Diagnóstico microbiológico • Directo /coloración de Gram • Cultivo • Agar chocolate /AS en placa • Tioglicolato • Ch/Sac/mag • Pruebas rápidas • Métodos moleculares

  9. Gram: rápido y económico

  10. Sensibilidad del Gram • Un resultado negativo no excluye meningitis bacteriana • Afectado por tratamiento ATB previo

  11. Sensibilidad de las técnicas de látex • Un resultado negativo no excluye meningitis bacteriana • Afectado por tratamiento ATB previo

  12. Agentes etiológicos. Año 2008

  13. Streptococcus pneumoniae

  14. Factores de virulencia:CÁPSULA (90 serotipos) Polisacáridos unidos covalentemente a la superficie del microorganismo a través del peptidoglicano y el polisacárido de la pared celular Virulencia cepas capsuladas = 105 virulencia cepas no capsuladas

  15. Identificación en el laboratorio αhemólisis en agar sangre de carnero Neumolisina degrada parcialmente la hemoglobina

  16. Factores que influyen en la hemólisis • Composición del medio de cultivo • Origen de la sangre : ovina • Proporción de sangre: 5-7% • Medio base: exento de carbohidratos: ATS, agar COLUMBIA. No usar MH, CC(descenso de pH = inhibición de hemolisinas) • Atmósfera de incubación

  17. Reacciones bioquímicas + - • Catalasa – • Soluble en sales biliares • Sensible a optoquina • Reacción de Quellung (serotipos capsulares)

  18. OPTOQUINA • Discos comerciales 5µg (clorhidrato de etilhidrocupreína) • Agar sangre de carnero • Incubación a 35 °C en lata con vela (5% CO2 ) • Zona de inhibición ≥14 mm = Spn • Control de calidad: S. pneumoniaeATCC 49619 E. faecalisATCC 29212

  19. Characterization of In Vitro-Generated and Clinical Optochin-Resistant Strains of Streptococcus pneumoniae Isolated from ArgentinaPaulo R. Cortes, Andrea G. Albarracín Orio,Mabel Regueira, Germán E. Piñas, and José EcheniqueJOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2008, p. 1930–1934 Vol. 46, No. 6 Son sensibles a OPTO el 100% de los neumococos? • Cepas resistentes a optoquina ( Optr )se han descripto desde 1987 en Estados Unidos, España, Israel y más recientemente en Portugal y Brasil • 1375 aislamientos de sitios estériles de niños de Argentina 1995-2004 • 8 Optr • Mutaciones puntuales en los genes atpAC que codifican subunidades a y c de la ATPasa F0F1

  20. Conclusiones • Origen de las cepas Optr ??? • Tratamiento de malaria con quinina y mefloquina? No hay reportes en zonas de malaria endémica Mutaciones espontaneas que no producen alteraciones fisiológicas, mantienen la virulencia y que no son seleccionadas x tratamiento ATB Characterization of In Vitro-Generated and Clinical Optochin-Resistant Strains of Streptococcus pneumoniae Isolated from ArgentinaPaulo R. Cortes, Andrea G. Albarracín Orio,Mabel Regueira, Germán E. Piñas, and José EcheniqueJOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2008, p. 1930–1934 Vol. 46, No. 6

  21. SOLUBILIDAD EN BILIS • Método en tubo • Suspensión 1 Mc Farland en SF del microorganismo a ensayar. • Fraccionar en 2 tubos de hemólisis (0.5ml/tubo) • Igual volumen de SF en tubo control (1) • Igual volumen de desoxicolato de sodio 10 % en el tubo prueba (2) • Incubar 3 horas a 35°C. Verificar cada hora Prueba +: aclaramiento de la suspensión que contiene la bilis Prueba no válida: aclaramiento de la prueba y el control: Contaminación con detergente, EDTA u otro agente activador de la autolisina En suspensión ácida puede producirse un falso (-) por precipitación del desoxicolato de sodio

  22. SOLUBILIDAD EN BILIS • Método en placa • Placa de 24hs con colonias a ensayar • Solución al 10% de desoxicolato de sodio (pH7) • Incubar 15 minutos a 35°C. • No agitar la placa, mantener a nivel Prueba +: achatamiento o desaparición de la colonia Verificar que la sangre debajo de la colonia se torne levemente hemolisada

  23. REACCIÓN DE NEUFELD-QUELLUNGManual of Clinical Microbiology 5th ed. • Fundamento: Unión del polisacárido capsular con el antisuero específico produce un cambio en el índice de refracción lo que hace más visible la cápsula. Produce un efecto visual de hinchamiento capsular • Staten Serum Institute, Copenhagen Denmark • Antisueros polivalentes (omni-serum) • Pool de antisueros A a I entre 7 y 11 antisueros por pool

  24. Procedimiento • 1 gota (cultivo, suspensión, líquido biológico) • 1 ansada de antisuero. Mezclar • 1 ansada de solución acuosa de azul de metileno, mezclar • Colocar cubreobjetos • Esperar 10 minutos • Examinar con objetivo de inmersión (100x)

  25. Reacción de Quellung Serotipos capsulares más frecuentes en Argentina: 14, 5, 1, 6A/6B, 7F, 9V, 19A, 19F, 23F

  26. Resistencia antibióticaSpn R a penicilina

  27. Resistencia a βlactámicos: modificación de PBP

  28. Emergencia y diseminación de Spn resistentes

  29. DETECCIÓN DE LA RESISTENCIA A PENICILINA TEST DE DIFUSIÓN: OXA 1 µg Excelente predictor de sensibilidad a penicilina OXA > 20 mm CIM penicilina< 0.06 µg/ml No puede categorizar el nivel de resistencia OXA <19 mm No diferencia entre peni R y peni I Baja especificidad OXA <19 mm Falsa resistencia 1-9%

  30. ALGORITMO DE TRABAJO Ensayar disco de OXA 1 µg • Halo de inhibición > 20 mm sensible a Penicilina • Halo de inhibición < 19 mm realizar ensayo de CIM para Penicilina y Cefotaxima

  31. Para aislamientos con diámetros de oxacilina < 19 mm no se puede reportar como peni R sin realizar un ensayo de CIM.

  32. PRUEBAS DE SENSIBILIDADNormas CLSI 2010 • Condiciones de ensayo • Difusión: AMH con 5% de sangre de oveja • Inóculo: suspensión de colonia 0.5 McFarland • Incubación: 35+ 2°C 5% CO2 20-24 hs. • Control de calidad: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

  33. Distribución de los valores de la CIM para penicilina Período: enero 2004-diciembre 2009 N° aislamientos: 250 19.8% 80.2% CIM 90: 0.125 µg/ml. Metodología: E-Test RANGO: 0.001-2 µg/ml

  34. Distribución de los valores de la CIM para cefotaxima: meningitis Período: enero 2004-diciembre 2009 N° aislamientos: 250

  35. Neisseria meningitidis

  36. Factores de virulencia Polisacárido capsular Cápsula=serogrupo (13) A B, C, W135, Y Por A= serosubtipos (10) Por B= serotipos (20) Lipoligosacáridos=inmunotipos (13) NOMENCLATURA= serogrupo:serotipo:serosubtipo:inmunotipo

  37. Variación antigénica Harrison, L. 2006. CMR 19: 142-164

  38. Diagnóstico microbiológico • Gram • Cultivo • Oxidasa (tetrametilp- fenilendiamina) • Azúcares (CTA) • Seroagrupamiento

  39. PCR Identificación de Nm: Amplificación del gen crgA(regulación de la adhesión de Nm a las células blanco) Identificación del serogrupo: multiplex PCR (A, B, C, Y/W135) Taha,M. 2000 JCM 38: 855-857.

  40. Amplificación del gen crgA por PCR. Calle 1: espécimen clínico; calle 2: control positivo; calle 3: control negativo; calle 4: marcador de peso molecular (el tamaño del fragmento se indica en pares de bases a la derecha) 1 2 3 4 900 230pb 200 100 50

  41. Amplificación del gen siaD (serogrupos B, C, Y y W135) y mynB (serogrupo A). Calle 1: marcador de peso molecular (el tamaño del fragmento se indica en pares de bases a la izquierda); calle 2: espécimen clínico; control positivo de serogrupo B (calle 3), C (calle 4), Y (calle 5) y W135 (calle 6); calle 7: control negativo. 1 2 3 4 5 6 7

  42. Resultados de PCR y cultivo de LCR en pacientes con posible enfermedad invasiva meningococcica (n=68) DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MENINGITIS POR NEISSERIA MENINGITIDIS Sebastián Oderiz1, Cecilia Vescina1, Maria Rosa Agosti2, Silvia E. González Ayala2XII Congreso Argentino de Microbiología. Buenos Aires 2010.

  43. Genoagrupamiento por PCR (n=41) DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MENINGITIS POR NEISSERIA MENINGITIDIS Sebastián Oderiz1, Cecilia Vescina1, Maria Rosa Agosti2, Silvia E. González Ayala2XII Congreso Argentino de Microbiología. Buenos Aires 2010.

  44. Pruebas de sensibilidad

  45. Mecanismo de resistencia a penicilinano enzimático

  46. Distribución de los valores de la CIM a penicilina Período 2004-2008

  47. Mecanismo de resistencia enzimático

  48. Emergencia de sensibilidad disminuída a fluorquinolonas Detección en el laboratorio: Disco de ácido nalidíxico

  49. Vigilancia de Neisseria meningitidis en Argentina,1993-2005: distribución de serogrupos, serotipos yserosubtipos causantes de enfermedad invasivaL. CHIAVETTA1*, E. CHÁVEZ1, A. RUZIC1, M. MOLLERACH2 , M. REGUEIRA1